不同濃度依托咪酯誘導人肝癌HepG2細胞體外凋亡的研究

王泓源等

[摘要] 目的 探討不同濃度的依托咪酯是否具有直接誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用，尋找依托咪酯臨床治療的新途徑。 方法 人肝癌細胞株HepG2體外擴增培養(yǎng)備用，選取不同濃度的依托咪酯E1、E2、E3和對照組（空白），分別培養(yǎng)12h、24h、48h后觀察。 結(jié)果 與空白對照組相比，培養(yǎng)12h、24h、48h后E1組、E2組人肝癌細胞株HepG2細胞凋亡率無明顯差異E3組凋亡率不斷增加，E1與E3組對比人肝癌細胞株HepG2細胞凋亡率具有顯著性差異E2與E3組對比人肝癌細胞株HepG2細胞凋亡率具有明顯差異結(jié)論 依托咪酯在臨床安全有效的濃度下不直接誘導人肝癌HepG2細胞的體外凋亡，濃度及時間達到一定峰值時可具有直接誘導人肝癌HepG2細胞體外凋亡的作用。

[關(guān)鍵詞] 依托咪酯；HepG2細胞；腎上腺；免疫；細胞凋亡

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）10-24-03

[Abstract] Objective To explore the different concentrations of etomidat whether directly induce the cell apoptosis to seek open up new ways of etomidate clinical treatment. Methods Human liver HepG2 cell line were amplificated cultivation for use in vitro， choose different concentrations of etomidate E1， E2 and E3 （blank） as control group.HepG2 were observed respectively after 12h， 24h， and 48h.With liver cancer HepG2 cell lines as target cells. Results Compared with the blank control group， 12h， 24h， 48h after culture E1 and E2 group liver HepG2 cell line apoptosis rate has no obvious difference（P>0.05）， E3 group of apoptosis rate increased， and with significant difference （P<0.05）； As the extension of incubation time and concentration increasing， E1 and E2 group compared with liver HepG2 cell line apoptosis rate have no significant difference（t=1.732，P>0.05）， E1 and E3 group compared with liver HepG2 cell line apoptosis rate have significant difference（t=1.864，P<0.05），E2 and E3 group compared with liver HepG2 cell line apoptosis rate have obvious difference （t=1.691， P<0.05）. Conclusion Etomidate with safe and effective concentrations in clinical are not directly induced HepG2 liver cancer cell apoptosis in vitro， but when concentration and time reach a certain peak can be directly induced the hepatocellular carcinoma HepG2 cells apoptosis in vitro.

[Key words] Etomidate； HepG2 cells； Adrenal gland； Immunity； Apoptosis

依托咪酯可以直接抑制HL-60的細胞活性，并且誘發(fā)該細胞的凋亡，也有相關(guān)文獻報道依托咪酯對鼠肝線粒體能量代謝有影響，還有對肝臟缺血-再灌注損傷的保護均有作用[1-4]，那么依托咪酯是否也會直接誘發(fā)人肝癌HepG2細胞的凋亡呢？我們提出了該研究的假設(shè)。本文設(shè)計不同濃度的依托咪酯是否具有直接誘導該細胞凋亡的作用，2.1.1 細胞凍存 取1mL的胰酶消化2min后，將對數(shù)生長期的細胞從培養(yǎng)瓶表面貼壁沖洗下去，并懸浮于3mL的培養(yǎng)液中，用1000rpm離心5min，去上清液。將人肝癌HepG2細胞懸浮于1mL的凍存液中，調(diào)整細胞濃度至106/mL，每個凍存管中加入1mL的細胞凍存液，放置-20℃冰箱內(nèi)保存2h，然后置于-80℃冰箱過夜。

2.1.2 細胞復蘇 將凍存?zhèn)溆玫募毎湃?7℃的水浴箱內(nèi)融化復蘇。

2.1.3 細胞培養(yǎng) 將人肝癌HepG2細胞放置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代培養(yǎng)1次，細胞貼壁達到70%時，以0.25%胰酶消化，使細胞全部都浸于溶液，倒置顯微鏡下觀察，細胞變圓后，但尚未漂起時加入5mL培養(yǎng)液終止消化，然后分到另兩個培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基后再放置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞。

2.1.4 細胞傳代 采用倒置顯微鏡觀察細胞貼壁生長狀況，當生長至80%以上時，用0.25%胰酶消化進行傳代，并置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

4 討論

依托咪酯為臨床常用的一種麻醉劑，在靜脈麻醉過程中只需一次給藥就可以獲得很好的效果，但是依托咪酯所產(chǎn)生的毒性作用也是麻醉劑中獨有的，它可以促進免疫細胞的凋亡。許多國內(nèi)學者研究依托咪酯誘導腫瘤細胞凋亡作用，從而分析依托咪酯的藥理學和臨床治療的意義。有研究表明[5-8]，小劑量依托咪酯對人急性髓性細胞白血病細胞具有一定的抑制作用。

為探討不同濃度的依托咪酯是否具有直接誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用而進行該試驗。采用小劑量和大劑量的依托咪酯做細胞凋亡分析，綜合相關(guān)文獻，參照依托咪酯對外周血單個核細胞凋亡影響的試驗方法及藥物劑量規(guī)格[9-12]，觀察該細胞正常時細胞凋亡情況，以及分別給予小劑量0.5μg/mL，5μg/mL的依托咪酯、大劑量50μg/mL后12h、2h、48h依托咪酯時對人肝癌HepG2細胞凋亡的情況。實驗結(jié)果證明依托咪酯誘導人肝癌細胞株HepG2細胞的凋亡具有一定的濃度-效應(yīng)與時間-效應(yīng)的關(guān)系，為依托咪酯開辟臨床治療的新途徑。

[參考文獻]

[1] 于航，賈慶波，王璐.缺血后處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠 caspase-3 的影響[J].中國應(yīng)用生理學雜志，2007，25（1）：6-8.

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[3] Delogu G，Moretti S，F(xiàn)amularo G，et al.Circulating neutrophils exhibit enhanced apoptosis associated with mitochondrial dysfunctions aftersurgery under general anaesthesia[J].Acta Anaesthesiol Scand，2001，45（1）：87-94.

[4] 郝宇華.缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注損失的保護作用[D].天津：天津醫(yī)科大學研究生院，2008：6.

[5] Katja C. Zimmermann，Christine Bonzon，Douglas R. Green.The machinery of programmed cell death[J]. Pharmacol & Therapeut，2001，92（1）：57-70.

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[7] Marieke den Brinker，KF.M.Joosten，Olivia Liem，et al.Adrenal Insufficiency in Meningococcal Sepsis：Bioavailable Cortisol Levels and Impact of Interleukin-6 Levels and Intubation with Etomidate on Adrenal Function and Mortality[J].J Clin Endocrinol Metab，2005，90（9）： 5110-5117.

[8] Ho-Kyung Song，Dae Chul Jeong.The Effect of Propofol on Cytotoxicity and Apoptosis of Lipopolysaccharide-Treated Mononuclear Cells and LympHocytes[J].Anesth Analg，2004，98（6）：1724-1728.

[9] 焦裕霞，熊君宇.依托咪酯誘發(fā)HL-60細胞凋亡以及預(yù)處理對其的抑制作用[D].大連：大連醫(yī)科大學，2007：6.

[10] Marieke den Brinker，KF.M. Joosten，Olivia Liem，et al.Adrenal insufficiency in meningococcal sepsis：Bioavailable cortisol levels and impact of interleukin-6 levels and intubation with etomidate on adrenal funtion and mortality[J].J Clin Endocrinol Metab，2005，90（9）：5110-5117.

[11] Ho-Kyung Song，Dae Chul Jeong.The effect of propofolon cytotoxi city and apoptosis of lipopolysacchari de-treated mononuclear cells and lymphocytes[J].Anesth Analg，2004，98（6）：1724-28.

[12] Rasola A，Bernardi P.The mitochon drial permeability transition poreand its involveement in cell death and indisease pathogenesis[J]. Apoptosis，2007，12（5）：815-833.

（收稿日期：2014-03-10）

4 討論

依托咪酯為臨床常用的一種麻醉劑，在靜脈麻醉過程中只需一次給藥就可以獲得很好的效果，但是依托咪酯所產(chǎn)生的毒性作用也是麻醉劑中獨有的，它可以促進免疫細胞的凋亡。許多國內(nèi)學者研究依托咪酯誘導腫瘤細胞凋亡作用，從而分析依托咪酯的藥理學和臨床治療的意義。有研究表明[5-8]，小劑量依托咪酯對人急性髓性細胞白血病細胞具有一定的抑制作用。

為探討不同濃度的依托咪酯是否具有直接誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用而進行該試驗。采用小劑量和大劑量的依托咪酯做細胞凋亡分析，綜合相關(guān)文獻，參照依托咪酯對外周血單個核細胞凋亡影響的試驗方法及藥物劑量規(guī)格[9-12]，觀察該細胞正常時細胞凋亡情況，以及分別給予小劑量0.5μg/mL，5μg/mL的依托咪酯、大劑量50μg/mL后12h、2h、48h依托咪酯時對人肝癌HepG2細胞凋亡的情況。實驗結(jié)果證明依托咪酯誘導人肝癌細胞株HepG2細胞的凋亡具有一定的濃度-效應(yīng)與時間-效應(yīng)的關(guān)系，為依托咪酯開辟臨床治療的新途徑。

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（收稿日期：2014-03-10）

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依托咪酯為臨床常用的一種麻醉劑，在靜脈麻醉過程中只需一次給藥就可以獲得很好的效果，但是依托咪酯所產(chǎn)生的毒性作用也是麻醉劑中獨有的，它可以促進免疫細胞的凋亡。許多國內(nèi)學者研究依托咪酯誘導腫瘤細胞凋亡作用，從而分析依托咪酯的藥理學和臨床治療的意義。有研究表明[5-8]，小劑量依托咪酯對人急性髓性細胞白血病細胞具有一定的抑制作用。

為探討不同濃度的依托咪酯是否具有直接誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用而進行該試驗。采用小劑量和大劑量的依托咪酯做細胞凋亡分析，綜合相關(guān)文獻，參照依托咪酯對外周血單個核細胞凋亡影響的試驗方法及藥物劑量規(guī)格[9-12]，觀察該細胞正常時細胞凋亡情況，以及分別給予小劑量0.5μg/mL，5μg/mL的依托咪酯、大劑量50μg/mL后12h、2h、48h依托咪酯時對人肝癌HepG2細胞凋亡的情況。實驗結(jié)果證明依托咪酯誘導人肝癌細胞株HepG2細胞的凋亡具有一定的濃度-效應(yīng)與時間-效應(yīng)的關(guān)系，為依托咪酯開辟臨床治療的新途徑。

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[9] 焦裕霞，熊君宇.依托咪酯誘發(fā)HL-60細胞凋亡以及預(yù)處理對其的抑制作用[D].大連：大連醫(yī)科大學，2007：6.

[10] Marieke den Brinker，KF.M. Joosten，Olivia Liem，et al.Adrenal insufficiency in meningococcal sepsis：Bioavailable cortisol levels and impact of interleukin-6 levels and intubation with etomidate on adrenal funtion and mortality[J].J Clin Endocrinol Metab，2005，90（9）：5110-5117.

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[12] Rasola A，Bernardi P.The mitochon drial permeability transition poreand its involveement in cell death and indisease pathogenesis[J]. Apoptosis，2007，12（5）：815-833.

（收稿日期：2014-03-10）