正常大鼠膽管細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的異質(zhì)性

程 龍，駱助林，向 珂，趙禮金

(1.成都軍區(qū)總醫(yī)院 全軍普通外科中心，四川 成都 610083；2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 遵義 563099)

膽管樹是一個(gè)不同管徑的、相互交通的三維網(wǎng)絡(luò)，從赫氏管向肝外肝膽管延伸。而被覆膽管的上皮細(xì)胞在發(fā)育上、結(jié)構(gòu)上、功能上是一個(gè)不均一的細(xì)胞群體[1- 2]。膽管細(xì)胞對(duì)膽汁中膽鹽重吸收的異質(zhì)性在膽管細(xì)胞生理及病理過程中具有重要意義[3]。膽管細(xì)胞膽鹽重吸收功能的異質(zhì)性決定于膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的差異。然而，目前尚無膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大、小膽管中表達(dá)差異的對(duì)比研究。本研究重點(diǎn)檢測和分析頂側(cè)鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Apical sodium-dependent bile acid transporter, ASBT)、回腸膽汁酸結(jié)合蛋白(Ileum bile acid binding protein, IBABP)和基底側(cè)有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體α(Organic solute transporter alpha OSTα)等膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大鼠不同節(jié)段膽管中的表達(dá)差異，為研究膽管細(xì)胞膽鹽重吸收異質(zhì)性在膽管疾病發(fā)生中的作用奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性Spragure-Dawley(SD)大鼠，二級(jí)動(dòng)物，體重200～250g，購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠飼養(yǎng)于恒溫、清潔環(huán)境，維持12h晝夜節(jié)律，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及管理原則。

1.2 大、小膽管的分離 參考我們前期研究中的肝內(nèi)膽管分離方法[4]。SD大鼠麻醉后(戊巴比妥，50 mg/kg)，取上腹部橫切口逐層進(jìn)腹；22G留置針行門靜脈穿刺置管，用D-Hank’s持續(xù)灌注5min后，換用含0.05%IV型膠原酶的D-Hank’s液繼續(xù)灌注10 min；移出肝臟置于膽管細(xì)胞生長培養(yǎng)基中(含DMEM/F12=1∶1基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，100 U/L青-鏈雙抗，400 μg/L地塞米松，10 g/L胰島素，25 μg/L表皮生長因子)，鈍性分離以去除肝實(shí)質(zhì)及肝靜脈，剩余肝內(nèi)膽管樹部分；在手術(shù)顯微鏡下將膽管樹分為大膽管和小膽管兩部分組織，即以第三級(jí)膽管分支末端為界，近端為小膽管組織，遠(yuǎn)端為大膽管組織(見圖1A～B)，膽管組織存于液氮中用于蛋白及RNA提取。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá) 通過免疫組織化學(xué)法檢測大鼠肝膽管ASBT、IBABP及Ostα的表達(dá)。一抗分別為：ASBT, Santa cruz,1∶200；IBABP, Santa cruz, 1∶200； Ostα, Abcam, 1∶100。PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。選用SABC免疫組織化學(xué)檢測試劑盒進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下分別觀察。

1.4 RNA提取和Real-time PCR檢測 采用RNAiso Plus提取總RNA，PrimscriptTMRT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅲ試劑盒行Real-time PCR，引物序列和產(chǎn)物大小(見表1),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)合成。反應(yīng)條件及試劑均參照說明書進(jìn)行。根據(jù)電泳結(jié)果確保所得產(chǎn)物，采用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法得到數(shù)據(jù)。

1.5 蛋白提取和Western blot檢測 膽管蛋白的提取參考既往文獻(xiàn)[4]。提取蛋白置于-80 ℃保存，應(yīng)用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每孔道上樣50 μg，8%SDS-PAGE凝膠電泳20 V，2h后80 V，3 h。200 mA轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，室溫下孵育一抗(ASBT, 1∶500；IBABP, 1∶500； Ostα, 1∶1 000)、二抗2 h，應(yīng)用發(fā)光試劑顯影及X膠片成像。掃描膠片后應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行灰度測定。

注：A：大鼠膽管樹的實(shí)物圖：利用膠原酶灌注消化輔助機(jī)械分離方法獲得完整的膽管樹，完整的大鼠膽管系統(tǒng)包括:①尾狀葉,②右葉,③中葉,④左中葉, ⑤左外葉及⑥盤狀突的分支系統(tǒng)；B：大鼠大、小膽管分離的模式圖：在手術(shù)顯微鏡下，以三級(jí)膽管分支末端(虛線)為界將膽管組織分為兩部分，靠近肝門的部分主要含有大膽管，周圍的部分主要含較小膽管。 圖1 大、小膽管的分離方法

表1引物序列及產(chǎn)物大小

基因名稱引物溫度長度ASBT上游 5’-CAGTTTGGAATCATGCCTCTC-3’ 下游 5’-AAGGGGCATCATTCCAAGAGC-3’56℃207bpIBABP上游 5’-CTTCACCTGGTCCCAGTCT-3’下游 5’-CAACTTGTCACCCACGAC-3’55℃187bpOstα上游 5’-CCCTCATACTTACCAGGAAGAAGCTAC-3’下游 5’-CCATCAGGAATGAGAAACAGGC-3’58 ℃109bpβ-actin上游 5’-ATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3’下游 5’-TCTTGCTCTGGGCCTCGTC-3’57℃174bp

2 結(jié)果

2.1 ASBT在正常大鼠膽管中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)顯示ASBT表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞頂側(cè)細(xì)胞膜，且主要表達(dá)于大膽管，隨著膽管直徑變小，其表達(dá)量也逐漸降低，至匯管區(qū)周圍小膽管幾乎無表達(dá)(見圖2A～B)。Real time PCR檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中ASBT mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.59±0.10和0.26±0.07；Western blotting檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中ASBT蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.84±0.21和0.49±0.18。統(tǒng)計(jì)分析表明，大膽管中ASBT的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于小膽管(P<0.05，見圖2C～D) 。

注：A：免疫組織化學(xué)顯示ASBT表達(dá)于大膽管上皮細(xì)胞頂側(cè)細(xì)胞膜，IHC×400；B：隨著膽管直徑變小，ASBT其表達(dá)量也逐漸降低，至匯管區(qū)周圍小膽管幾乎無表達(dá)，IHC×400；C：Real time PCR結(jié)果顯示大膽管中ASBT的mRNA表達(dá)水平顯著高于小膽管；D：Western blotting結(jié)果也顯示大膽管中ASBT的蛋白表達(dá)水平顯著高于小膽管。 圖2 正常大鼠大、小膽管中ASBT的表達(dá)差異

2.2 IBABP在正常大鼠膽管中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)顯示IBABP表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，主要表達(dá)于大膽管，隨著膽管直徑變小，其表達(dá)量也逐漸降低，至匯管區(qū)周圍小膽管幾乎無表達(dá)(見圖3A～B)。Real time PCR檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中IBABP mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.66±0.12和0.20±0.06；Western blotting檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中IBABP蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.56±0.11和0.17±0.08。統(tǒng)計(jì)分析表明，大膽管組織中IBABP的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于小膽管(P<0.01，見圖3C～D)。

注：A：免疫組織化學(xué)顯示IBABP表達(dá)于大膽管上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，IHC×400；B：隨著膽管直徑變小，IBABP其表達(dá)量也逐漸降低，至匯管區(qū)周圍小膽管幾乎無表達(dá)，IHC×400；C：Real time PCR結(jié)果顯示大膽管中IBABP的mRNA表達(dá)水平顯著高于小膽管；D：Western blotting結(jié)果也顯示大膽管中ASBT的蛋白表達(dá)水平顯著高于小膽管。 圖3 正常大鼠大、小膽管中IBABP的表達(dá)差異

2.3 Ostα在正常大鼠膽管中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)顯示Ostα表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞基底側(cè)膜上，大、小膽管表達(dá)無顯著差異，且Ostα也表達(dá)與肝細(xì)胞血竇面(見圖4A～B)。Real time PCR檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中Ostα mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.39±0.05和0.52±0.06；Western blotting檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中Ostα蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.72±0.12和0.83±0.21。統(tǒng)計(jì)分析表明，大、小膽管組織中Ostα mRNA和蛋白的表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖4C～D)。

注：A：免疫組織化學(xué)顯示Ostα表達(dá)于大膽管上皮細(xì)胞基底側(cè)胞膜，IHC×400；B：Ostα在小膽管細(xì)胞中也有表達(dá)，主要位于膽管上皮細(xì)胞基底側(cè)胞膜，表達(dá)量與大膽管無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IHC×400；C：Real time PCR結(jié)果顯示大、小膽管中Ostα的mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D：Western blotting結(jié)果也顯示大、小膽管中Ostα的蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 圖4 正常大鼠大、小膽管中Ostα的表達(dá)差異

3 討論

越來越多的研究證實(shí)膽管細(xì)胞在形態(tài)和功能上存在異質(zhì)性[1-2]。本研究著眼于膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)及其相關(guān)蛋白表達(dá)的差異。膽管細(xì)胞頂側(cè)面暴露于高濃度的膽汁酸，膽管細(xì)胞與膽汁酸之間存在相互作用。膽管細(xì)胞頂側(cè)細(xì)胞膜表達(dá)一種鈉依賴性的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(ASBT)，膽汁中膽汁酸可經(jīng)ASBT進(jìn)入膽管細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)與膽汁酸結(jié)合蛋白(IBABP)結(jié)合，從細(xì)胞膜頂側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞基底側(cè)，經(jīng)細(xì)胞基底膜上的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)入膽管周圍血管叢，從而進(jìn)入門脈系統(tǒng)。經(jīng)膽管細(xì)胞單向性轉(zhuǎn)運(yùn)入門脈系統(tǒng)的膽汁酸可經(jīng)肝細(xì)胞重新分泌入膽汁，形成膽汁酸的膽肝循環(huán)[5]。近來研究表明，膽肝循環(huán)可能在膽汁酸的肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)體系中具有重要作用，且參與了膽道梗阻引起的慢性膽汁淤積的適應(yīng)性反應(yīng)。膽汁酸從膽汁中轉(zhuǎn)運(yùn)入膽管細(xì)胞是膽汁酸膽肝循環(huán)的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)。目前膽管細(xì)胞頂側(cè)膜表達(dá)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體只有ASBT得到公認(rèn)。細(xì)胞基底側(cè)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)可能由MRP3和Ostα-Ostβ異二聚體完成，而研究表明Ostα-Ostβ異二聚體起主要作用，而MRP3起輔助作用。有研究報(bào)道ASBT主要表達(dá)于大膽管細(xì)胞[6]，而IBABP和Ostα-Ostβ在膽管組織中的表達(dá)情況尚無明確研究報(bào)道。

本研究通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)ASBT僅表達(dá)于直徑大于15μm的大膽管的上皮細(xì)胞頂側(cè)細(xì)胞膜上，而在直徑小于15μm的小膽管的上皮細(xì)胞無表達(dá)，這與以往研究報(bào)道一致。IBABP也只表達(dá)于大膽管上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，而不表達(dá)于小膽管細(xì)胞。與ASBT和IBABP不同，Ostα-Ostβ在大膽管和小膽管上皮細(xì)胞均表達(dá)，且都定位于膽管細(xì)胞基底側(cè)細(xì)胞膜，同時(shí)在肝細(xì)胞的血竇面也可見表達(dá)。Western blot檢測也顯示在三級(jí)分支末端之前的較大膽管組織中ASBT和IBABP的表達(dá)顯著高于其在三級(jí)分支末端之后的較小膽管組織的表達(dá)，而Ostα-Ostβ在兩者中表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，盡管Ostα-Ostβ在大小膽管均有表達(dá)，而在膽肝循環(huán)中起始動(dòng)作用的ASBT以及IBABP只表達(dá)于大膽管，所以膽管細(xì)胞對(duì)膽汁酸的重吸收也只能發(fā)生于大膽管。

由于進(jìn)入膽管細(xì)胞的膽汁酸可發(fā)揮信號(hào)分子的作用，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+，PKC，PI3K，絲裂原激活蛋白(MAP)激酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶等信號(hào)途徑的改變，顯著影響膽管細(xì)胞分泌功能，并在膽管細(xì)胞增生、凋亡及膽管周圍纖維化過程中起重要作用[7-8]。 所以膽汁酸在膽管細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)的平衡對(duì)維持膽管細(xì)胞正常生理功能和在免受膽汁酸毒性作用具有重要意義。在一些病理情況下，這種平衡可能會(huì)被破壞，引起膽管細(xì)胞的相應(yīng)病理生理學(xué)改變，從而參與了膽管疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明，膽汁酸重吸收可能只發(fā)生于大膽管，因此，膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)不平衡而引起膽鹽在細(xì)胞內(nèi)異常聚集可能也只發(fā)生于較大膽管上皮細(xì)胞，從而參與了主要累及較大膽管的膽管病的發(fā)生發(fā)展。肝移植后缺血型膽管病變是主要累及三級(jí)以上大膽管的彌漫性病變，且有研究顯示膽汁毒性在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用[9-10]。且在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，肝移植后，膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)呈現(xiàn)不平行的改變，且供肝冷缺血時(shí)間越長，這種不平行的程度越大，膽管損傷越重[4]。因此，我們推測，由于膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)不平行導(dǎo)致了毒性膽鹽中細(xì)胞內(nèi)異常聚集而引起細(xì)胞損傷；而由于膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)主要發(fā)生在大膽管，因此肝移植后缺血型膽管病主要發(fā)生在大膽管。然而，這一推測尚需要進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

綜上所述，由于ASBT和IBABP只表達(dá)于大膽管上皮細(xì)胞，Ostα同時(shí)表達(dá)于大膽管和小膽管上皮細(xì)胞，因此，膽管細(xì)胞對(duì)膽汁酸的重吸收主要發(fā)生于大膽管。研究膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的差異與膽管疾病發(fā)生的關(guān)系及分子基礎(chǔ)，不僅有助于闡明肝移植后缺血型膽管病的發(fā)生機(jī)制，而且也將為探索其他膽管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的思路。

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