TTF-1啟動子調(diào)控microRNA-7真核表達載體的構(gòu)建

陳 超，趙娟娟，胡 艷，郭萌萌，陶弋婧，周 涯，秦娜琳，鄭 靜，徐 林

(1.遵義醫(yī)學院 免疫學教研室暨貴州省免疫學研究生創(chuàng)新基地，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學物理學教研室，貴州 遵義 563099)

近年來研究顯示，一類長度大約22nt的非編碼小分子RNA-微小RNA(microRNA,miRNA)在肺癌發(fā)生中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，且逐漸發(fā)展為肺癌臨床診斷和基因治療的重要靶標[1-4]。新近研究顯示miRNAs家族成員miR-7在肺癌發(fā)生中具有重要作用，其低表達與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-7模擬物(mimics)可顯著抑制人肺癌細胞的體外增殖[6]。此外，基于CMV啟動子的miR-7的真核表達載體過表達miR-7可顯著抑制人肺癌細胞體內(nèi)外生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7-9]。然而，miR-7為代表的miRNAs分子是否可作為臨床肺癌基因治療或診斷靶標仍待繼續(xù)研究探討。

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(thyroid transcription factor-1,TTF-1)基因是1989年civitarale等在甲狀腺濾泡上皮細胞中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，其特征性表達于甲狀腺濾泡上皮細胞和肺上皮細胞中[10]。研究發(fā)現(xiàn)TTF-1在肺癌組織中高表達，且其表達水平與肺癌預后密切相關(guān)，提示其可作為肺癌基因靶向表達的重要候選靶標[11-12]。因此本研究中，我們擬利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建TTF-1啟動子調(diào)控miR-7的真核表達載體，并初步探討該真核載體過表達miR-7對人肺癌細胞體外生長的可能影響，以期為后續(xù)基于miR-7的臨床肺癌診斷和基因治療新靶標開發(fā)提供前期實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 PCR試劑，Premix Ex Taq Version2.0，限制性內(nèi)切酶，快速連接酶均購自Takara公司；引物合成由上海英駿公司完成，PGL3-basic載體購自Promega公司。質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自碧云天公司。人源性肺巨細胞癌95D細胞株，購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。DH5α大腸桿菌菌株由本實驗室保存。SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；空氣恒溫搖床(上海新苗醫(yī)療器械制造公司)；TD5A-WS臺式低速離心機(湘儀儀器)；IX-51倒置顯微鏡(OLYMPUS)；低溫臺式高速離心機(Thermo公司)；-80℃超低溫冰箱(Thermo公司)。

1.2 PCR擴增miR-7基因 根據(jù)pri-miR-7序列設(shè)計引物。上游引物:5’-CGACGCGTAAGAGAGAAATGAGCCACTTGC-3’；下游引物：5’-CCCAAGCTTCCTGCCACAGTGGGGGATG-3’； 劃痕為酶切位點。以人肺癌95D細胞基因組DNA為模板，PCR擴增miR-7序列，PCR條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.3 PGL3-basic-miR-7載體的構(gòu)建 將miR-7的PCR產(chǎn)物克隆入PGL3-basic載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Mul I酶和Hind Ⅲ酶做雙酶切鑒定，酶切鑒定后測序，通過測序鑒定后得到正確的重組質(zhì)粒PGL3-basic-miR-7。

1.4 PCR擴增TTF-1啟動子基因 根據(jù)TTF-1啟動子序列設(shè)計引物。上游引物：5’-CGGGGTACCTGTTTCGGCAACTAC-3’；下游引物：5’-CGACGCGTCCTTCTGGGTCCTT-3’；劃痕為酶切位點。以人肺癌95D細胞基因組DNA為模板，PCR擴增TTF-1啟動子序列，PCR條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min20 s；35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 p-T-miR-7載體的構(gòu)建 將TTF-1啟動子的PCR產(chǎn)物克隆入PGL3-basic-miR-7載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Kpn I酶和Mul I酶做雙酶切鑒定，酶切鑒定后測序，通過測序鑒定后得到正確的重組質(zhì)粒p-T-miR-7。

1.6 Real-time PCR探針法分析各組細胞中miR-7表達情況。

1.6.1 引物設(shè)計 GAPDH 上游(5’-3’)GGTGAAGGTCGGAGTCAACG。下游(5’-3’) CAAAGTTGTCATGGATGGACC。miR-7逆轉(zhuǎn)錄GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAACAA，下劃線部分為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

注：A:下劃線部分為酶切位點。 圖1 PGL3.0-Basic-TTF-1-promoter-miR-7真核表達載體

1.6.2 總RNA提取 以上各組細胞用0.2%胰酶消化，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，移至離心管中，1 200 rmp離心5 min，取出倒掉上清液，彈開管底的沉淀物。向離心管中加入適量的 RNAiso Plus(10 cm295D細胞加入1 mL RNAiso Plus)，輕輕吹打，吸出至1.5 mL EP管，室溫靜置5 min，至完全融化。12 000g 4 ℃離心5 min，吸取上清液，移入新1.5 mL EP管中。向勻漿裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5體積)，劇烈振蕩15s，待溶液充分乳化后，室溫靜置5 min，12 000g 4 ℃離心15 min。取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻后，室溫下靜置10 min。12 000 g 4 ℃離心10 min。小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇1 mL，輕微上下顛倒洗滌，12 000 g 4 ℃離心5 min后棄去乙醇。室溫干燥沉淀2～5 min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀。1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性。

1.6.3 Real-time PCR探針法檢測miR-7表達 內(nèi)參基因GAPDH逆轉(zhuǎn)錄反應體系及條件按試劑盒說明書操作，Real-time PCR反應體系及條件： 2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 1μL，PCR Forward Primer(10 μM) 0.5 μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.5 μL；95℃預變性30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；84 ℃采集熒光信號，以排除引物二聚體的干擾。miR-7逆轉(zhuǎn)錄反應體系及條件按試劑盒說明書操作，Real-time PCR反應體系及條件：20×TaqMan?Small RNA Assay 1 μL，cDNA 1 μL，PCR Master Mix II 10 μL，ddH2O 8 μL；95 ℃預變性30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；60 ℃采集熒光信號[7]。

1.7 CCK-8實驗檢測細胞增殖情況 95D細胞以3×103個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基總量200 μL，分別將p-T-miR-7重組質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)72 h；每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；使用酶標儀檢測各孔吸光度(OD)值(波長450 nm)。

1.8 劃痕實驗檢測95D細胞的體外遷移 收集95D細胞，按細胞密度1×105個細胞/孔接種于24孔板，培養(yǎng)12 h；分別轉(zhuǎn)染p-T-miR-7質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒，培養(yǎng)6 h；用1mL槍頭沿板中線刮出2 mm刮痕，PBS洗滌3次，顯微鏡下觀察刮痕內(nèi)無細胞，加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；光學顯微鏡下計算刮痕內(nèi)細胞總數(shù)，并拍照。

1.9 克隆形成實驗檢測95D細胞的長期體外生長 分別轉(zhuǎn)染p-T-miR-7質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h；分別制成細胞懸液；將各轉(zhuǎn)染組按200、800個細胞/孔接種于6孔板中；置37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)10～15 d，中間根據(jù)培養(yǎng)基變化適時更換新鮮培養(yǎng)基，當出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，倒掉孔里的培養(yǎng)基，PBS小心洗滌2次，空氣干燥，4%多聚甲醛固定30 min，空氣干燥，用1%結(jié)晶紫染液染色30 min，洗去染液，干燥后拍照。

2 結(jié)果

2.1 PGL3-basic-miR-7真核表達載體的構(gòu)建 以人肺癌95D細胞基因組DNA為模板，PCR擴增miR-7前體序列，瓊脂糖凝膠電泳后在1302bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶(見圖2A)。經(jīng)Mul I酶和Hind Ⅲ酶雙酶切純化后，亞克隆入PGL3-basic載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后做菌液PCR鑒定(見圖2B)。進一步提取質(zhì)粒，利用Mul I酶和Hind Ⅲ酶做雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)了1302bp和4818左右的兩條帶(見圖2C)。并通過質(zhì)粒測序結(jié)果(見圖2D)，證明PGL3-basic-miR-7載體構(gòu)建成功。

注：A：PCR擴增miR-7片段；B：菌液PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；C：重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定；D：重組質(zhì)粒的測序鑒定。 圖2 PGL3-basic-miR-7載體構(gòu)建

2.2 p-T-miR-7真核表達載體的構(gòu)建 以人肺癌95D細胞基因為模板，PCR擴增TTF-1啟動子序列，瓊脂糖凝膠電泳后在2300bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶(見圖3A)。經(jīng)Kpn I酶和Mul I酶雙酶切純化后，亞克隆入PGL3-basi-miR-7載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后做菌液PCR鑒定(見圖3B)。進一步提取質(zhì)粒，利用Kpn I酶和Mul I酶做雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)了2300bp和6120bp左右的兩條帶(見圖3C)。并通過質(zhì)粒測序結(jié)果(見圖3D)，證明載體構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒p-T-miR-7瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌細胞后miR-7的表達水平 我們將p-T-miR-7重組質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒分別體外瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌95D細胞。72 h后，觀察細胞中miR-7成熟體的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組p-Cont轉(zhuǎn)染組相比，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組中miR-7成熟體的表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖4)。

2.4 瞬時轉(zhuǎn)染p-T-miR-7抑制95D細胞體外增殖 我們進一步觀察了人肺癌95D細胞體外生長的變化。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與p-Cont轉(zhuǎn)染組相比，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組95D細胞的生長明顯受到抑制，細胞數(shù)量明顯減少(見圖5A、B、C、D，P<0.05)；CCK-8檢測結(jié)果表明，細胞的增殖能力明顯下降，1.5μg和2.0μg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的D值分別為0.85±0.02和0.83±0.02，與p-Cont組D值1.22±0.02相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖5E)。

注：A：PCR擴增TTF-1啟動子片段；B：菌液PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；C：重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定；D：重組質(zhì)粒的測序鑒定。 圖3 p-T-miR-7載體構(gòu)建

圖4 Real-time PCR方法檢測p-T-miR-7轉(zhuǎn)染人肺癌95D細胞后miR-7的表達

2.5 瞬時轉(zhuǎn)染p-miR-7抑制95D細胞的長期體外生長 我們進而利用克隆形成實驗，觀察了p-T-miR-7轉(zhuǎn)染后對人肺癌細胞長期生長的作用。結(jié)果顯示，在接種200 cells/well和800 cells/well條件下，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組中95D細胞的克隆形成數(shù)較p-Cont轉(zhuǎn)染組均明顯降低(11±3 vs 30±3個，P<0.05；80±3 vs 160±4個，P<0.05)(見圖6A～D)。這提示，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組中95D細胞的長期生長能力也顯著削弱。

2.6 瞬時轉(zhuǎn)染p-T-miR-7抑制95D細胞的體外遷移 我們前期研究顯示，miR-7模擬物(mimics)可顯著抑制人肺癌細胞的體外遷移能力。為了進一步明確利用p-T-miR-7載體表達miR-7對人肺癌細胞的生物學特性的影響，我們又觀察了95D細胞體外遷移的變化。劃痕法結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-T-miR-7組細胞的體外遷移能力受到顯著抑制(120±5，45±3，40±3，P<0.05)，提示p-T-miR-7載體表達miR-7可抑制95D細胞體外遷移能力。

注：A：p-Cont組(2μg)； B：p-T-miR-7組(1.5μg)；C：p-T-miR-7組(2μg)；D：A-C組的細胞計數(shù)比較(*P<0.05)，E：CCK-8實驗結(jié)果(*P<0.05)。 圖5 瞬時轉(zhuǎn)染p-T-p-miR-7對人肺癌95D細胞體外生長的影響(×100)

注：A、B：p-Cont轉(zhuǎn)染組；C、D：p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組。A、C：200cells/well;B、D：800cells/well。 圖6 轉(zhuǎn)染p-T-miR-7抑制人肺癌95D細胞的克隆形成能力

注：A：p-Cont組(2μg)；B：p-T-miR-7組(1.5μg)；C：p-T-miR-7組(2μg)；D：A～C組劃痕部位的細胞計數(shù)比較(*P<0.05)。圖7 p-T-miR-7轉(zhuǎn)染抑制人肺癌95D細胞的體外遷移(×100)

3 討論

現(xiàn)有的臨床肺癌治療的主要方法有外科手術(shù)治療、化學治療、放射治療。但肺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程十分復雜，涉及多因素、多水平的分子調(diào)控機制，因此現(xiàn)有的治療方法的療效仍十分有限[13-15]。所以新治療策略的開發(fā)仍顯得十分必要。腫瘤的基因治療技術(shù)是近年來得到快速發(fā)展的一項生物學新技術(shù)，主要指將外源或內(nèi)源基因?qū)肽[瘤細胞以達到治療腫瘤的目的。目前，已知與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因數(shù)目龐大且機制復雜，其中近年發(fā)現(xiàn)的一類小分子RNA-miRNAs與肺癌間的關(guān)系已成為該領(lǐng)域的研究熱點和重點之一[16-17]。

越來越多的研究表明，miRNAs分子參與調(diào)控了生物體的生長發(fā)育過程并參與一系列的生命活動，如細胞的生長、侵襲、凋亡等等。如：我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-7在正常腦、胸腺、淋巴結(jié)等組織中均高表達，尤其以肺組織表達水平最高[18]。而在臨床肺癌組織中，miR-7的表達水平則顯著降低，且與肺癌細胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。同時，體外利用miR-7模擬物(mimics)可顯著抑制人肺癌細胞的體外增殖[6]。而Xiong[19]等的研究發(fā)現(xiàn)，miR-7在非小細胞肺癌細胞中呈現(xiàn)低表達，而miR-7模擬物可以抑制細胞的增殖和遷移并誘導其凋亡。此外他們的研究還顯示，miR-7的表達水平與Bcl-2呈負相關(guān)性。因此，該miRNA的缺失或表達水平下調(diào)，均可導致Bcl-2表達水平的升高，從而促進肺癌的發(fā)生。Lee等[20]的研究還提示，miR-7還可以增加肺癌細胞對化療的敏感性。我們在近期的研究中利用分子生物學技術(shù)成功構(gòu)建了基于CMV啟動子的miR-7的真核表達載體，發(fā)現(xiàn)過表達miR-7可顯著抑制人肺癌細胞體內(nèi)外生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7-9]。以上的研究表明：改變腫瘤細胞中特定miRNA分子的表達水平將為肺癌的基因治療提供了新的策略和嘗試。

在本研究中，我們構(gòu)建了TTF-1啟動子調(diào)控miR-7表達的真核表達載體，并觀察其在體外的表達活性。我們以人肺巨細胞癌細胞系95D細胞基因組DNA為模板，利用PCR分別擴增TTF-1啟動子序列和miR-7前體序列，純化產(chǎn)物分別經(jīng)Kpn I和Mul I雙酶切與Mul I和HindⅢ雙酶切，克隆入pGL3-basic-載體，分別經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定以及測序驗證，結(jié)果表明成功構(gòu)建了真核表達載體PGL3-basic-TTF-1-promoter-miR-7(命名為p-T -miR-7)。此外，我們發(fā)現(xiàn)將p-T-miR-7瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌95D細胞可顯著增加miR-7成熟體的表達水平，提示TTF-1啟動子可有效啟動miR-7在真核細胞中的表達。重要的是，CCK-8實驗和克隆形成實驗進一步顯示，轉(zhuǎn)染p-T-miR-7后，95D細胞的增殖和生長能力受到明顯抑制。同時劃痕法檢測結(jié)果顯示p-T-miR-7載體過表達miR-7后還可顯著抑制95D細胞的體外遷移，與我們前期發(fā)現(xiàn)CMV啟動過表達miR-7的結(jié)果是一致的[8-9]。這些結(jié)果提示基于TTF-1啟動子調(diào)控的miR-7真核表達載體可有效表達miR-7成熟體，且具有顯著的生物學效應。然而，TTF-1調(diào)控miR-7表達在人肺癌細胞中的確切靶向性仍待后續(xù)研究探討。

總之，在本研究中我們成功構(gòu)建TTF-1啟動子調(diào)控的miR-7真核表達載體，這為后續(xù)開發(fā)基于miR-7靶向基因治療肺癌的新策略提供了重要的前期實驗基礎(chǔ)。

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