雷帕霉素洗脫支架系統(tǒng)中雷帕霉素的含量測定

林紅賽，黃永富，李 劍，岳衛(wèi)華

(北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京101111)

雷帕霉素洗脫支架系統(tǒng)中雷帕霉素的含量測定

林紅賽，黃永富，李 劍，岳衛(wèi)華

(北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京101111)

目的：建立高效液相色譜法測定雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量測定的方法并對樣品制備方法進(jìn)行了驗(yàn)證。方法：用waters 1525高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，色譜柱為C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水(67∶15∶18)，流速1mL/min，紫外檢測器，檢測波長為280nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果：雷帕霉素的線性范圍為19.2～77.6μg/mL(r=0.9993)，檢出限為0.388μg/mL，平均加樣回收率為98.86%。結(jié)論：該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于雷帕霉素洗脫支架系統(tǒng)中雷帕霉素的含量測定。

雷帕霉素洗脫支架；雷帕霉素；高效液相色譜法

0 引言

雷帕霉素又稱西羅莫司，是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抑制血管平滑肌增殖、抑制血管內(nèi)膜增生的作用。該藥物覆蓋于支架表面，可起到防止血管再狹窄的作用。目前雷帕霉素洗脫支架在國內(nèi)臨床上應(yīng)用已較為普遍，而雷帕霉素洗脫支架產(chǎn)品還沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)可做質(zhì)量評價(jià)參考。文獻(xiàn)已有反相高效液相色譜法測定組織中或藥物中的雷帕霉素的含量，但尚無雷帕霉素洗脫支架產(chǎn)品中雷帕霉素含量測定方法，所以建立一種適用于雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量測定的準(zhǔn)確方法十分必要。本實(shí)驗(yàn)旨在建立評價(jià)雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量的測定方法并對樣品的制備方法的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料和方法

Waters高效液相色譜儀，配紫外檢測器(Waters公司)；電子天平(梅特勒-托利多公司)；雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度HPLC≥98%，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)；甲醇(色譜純，Merck KGaA)；乙腈(色譜純，Mreda technology Inc)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

(1)實(shí)驗(yàn)條件

色譜柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶水= 67∶15∶18；流速：1mL/min；檢測波長：280nm。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取對照品9.7mg，加入乙腈溶解并定容至25mL，得到濃度為388μg/mL的對照品儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液適量用乙腈逐級稀釋，得到濃度為19.2μg/mL、29.1μg/mL、38.8μg/mL、48.5μg/mL、58.2μg/mL和77.6μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(3)樣品的制備

取支架1個(gè)，放入5mL棕色瓶中，精密加入5mL乙腈，靜置1h，超聲10min，用0.45μm濾膜過濾，取濾液作為檢驗(yàn)液。

2 結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

將配制好的雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外分光光度計(jì)在190～700nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在280nm處有最大的吸收峰，故選擇280nm作為檢測波長。波長掃描圖見圖1。

圖1 雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液掃描圖

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取濃度為38.8μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液一份，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明雷帕霉素及其異構(gòu)體分離良好，雷帕霉素保留時(shí)間約為11min，理論塔板數(shù)大于3000，拖尾因子1.1；雷帕霉素異構(gòu)體保留時(shí)間約為13.48min，理論塔板數(shù)大于5000，拖尾因子1.1，色譜圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖

2.3 線性范圍

取標(biāo)準(zhǔn)溶液按“(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積(A)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=33722.8189C-130752.1；r=0.9993，該結(jié)果表明在19.2～77.6μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以響應(yīng)值較低的雷帕霉素異構(gòu)體計(jì)算檢出限，當(dāng)稀釋對照品溶液濃度至0.388μg/mL時(shí)，其信噪比(S/N)等于4.0，故檢出限約為0.388μg/mL(S/N=4.0)。

2.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，RSD為0.91%(n=5)。

室溫放置0h、4h和8h后的同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算雷帕霉素峰面積的RSD為1.3%。該結(jié)果表明雷帕霉素的乙腈溶液制備后室溫放置至少8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知濃度的樣品溶液9份，分別加入低、中、高三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測試3份，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，低、中、高濃度的平均回收率分別為98.66%、99.18和98.73，總平均回收率為98.86%。

Table 1 Results of recovery test

2.7 樣品制備方法的確定和測定結(jié)果

1)取按“(3)”項(xiàng)下洗脫后的支架，置于新的容器中，加入2.5mL乙腈溶劑，并確保支架完全浸沒于溶劑中，超聲30min，用0.45μm濾膜過濾，取濾液進(jìn)樣測定，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)雷帕霉素色譜峰。

2)取樣品，按“(3)”項(xiàng)下制備樣品，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件測定，按外標(biāo)法計(jì)算檢驗(yàn)液中雷帕霉素的含量，結(jié)果測得單個(gè)支架中雷帕霉素含量為141.04μg。

4 小結(jié)

(1)雷帕霉素在溶液中存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，異構(gòu)體色譜峰與雷帕霉素色譜峰的相對保留時(shí)間約為1.2min，在計(jì)算雷帕霉素含量時(shí)可將色譜圖中的雷帕霉素峰和雷帕霉素異構(gòu)體峰合并計(jì)算。

(2)單個(gè)雷帕霉素洗脫支架在5mL乙腈中靜置1h后，發(fā)現(xiàn)少量白色的涂層材料已被洗脫下來，故測定前需要過濾。洗脫后的支架再次超聲洗脫未發(fā)現(xiàn)雷帕霉素色譜峰，表明靜置1h后超聲10min的處理方法已能使支架中的雷帕霉素完全洗脫下來。

(3)本文建立了雷帕霉素洗脫支架高效液相色譜檢測方法，并對方法的有效性和樣品的制備方法進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果顯示本方法具有靈敏、快速、方便之特性，可以滿足雷帕霉素洗脫支架含量測定的要求。

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Determination of rapamycin in rapamycin -eluting stent by HPLC

LIN Hong-sai, HUANG Yong-fu, LI Jian, YUE Wei-hua

(No.7, Xingguang 2nd Street, Opto-Mechatronics Industial Park, Tongzhou District, Beijing, China, 101111)

Objective:To establish a method for determination of rapamycin in rapamycin-eluting stent by HPLC with ultraviolet detection and verify the efficiency of sample preparation. Method: HPLC analysis of rapamycin was performed by a Waters 1525 chromatography equipped with a C18 (250mm×4.6mm, 5μm) column and quantified by external standard method. The mobile phase was a mixture of methanol, acetonitrile and water (67∶15∶18) and the flow rate was 1mL/min. The detection wavelength was at 280nm.Result: The linear range of rapamycin was 19.2μg/mL～77.6μg/mL(r=0.9993).The limt detection was 0.388μg/mL and the average recovery was 98.86%. Conclusion: The method is simple, rapid and accurate for the content determination of rapamycin in rapamycin -eluting stent.

rapamycin ; rapamycin -eluting stent;HPLC

2014-01-15

R972

A

1002-2376(2014)08-0007-03