多發(fā)性骨髓瘤應(yīng)用熒光原位雜交檢測(cè)基因異常的價(jià)值

李文兵,李顯東

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

多發(fā)性骨髓瘤應(yīng)用熒光原位雜交檢測(cè)基因異常的價(jià)值

李文兵,李顯東

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

目的 探討應(yīng)用熒光原位雜交檢測(cè)法檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤基因異常的價(jià)值，進(jìn)一步分析臨床分期及免疫學(xué)分型特點(diǎn)。方法 選擇40例多發(fā)性骨髓瘤患者，對(duì)RB1、1q21、p53、D13S319以及IGH 5種基因行熒光原位雜交檢測(cè)，分析p53缺失、RB1缺失、1q21 擴(kuò)增及IGH基因的重排發(fā)生情況，并統(tǒng)計(jì)處理基因異常與免疫學(xué)分型以及臨床分期的關(guān)系。結(jié)果 RB1、1q21、p53、D13S319及IGH 5種基因的陽(yáng)性閾值分別為8.6%，7.2%，7.2%，7.9%和9.7%，40例患者中1q21 擴(kuò)增23例(58%)，同時(shí)檢測(cè)出RB1缺失以及D13S319缺失14例(35%)，p53缺失9例(22%)，IGH基因重排15例(38%)。臨床D-S分期與IGH重排有顯著相關(guān)性(r=0.425，P=0.001)，ISS分期與p53缺失有顯著相關(guān)性(r=-0.449，P=0.005)，免疫學(xué)分型與D13S319缺失有顯著相關(guān)性(r=-0.341，P=0.040)，其余幾種基因異常均無(wú)顯著相關(guān)性。結(jié)論 多發(fā)性骨髓瘤較為常見(jiàn)的基因異常主要為p53缺失、RB1 缺失、1q21 擴(kuò)增及IGH基因的重排，應(yīng)用熒光原位雜交檢測(cè)能夠較好地分析基因異常與多發(fā)性骨髓瘤的關(guān)聯(lián)性以及預(yù)后，值得臨床予以廣泛性推廣應(yīng)用。

多發(fā)性骨髓瘤；熒光原位雜交；基因異常；檢測(cè)率

多發(fā)性骨髓瘤(MM)主要特征為骨髓克隆性漿細(xì)胞異常積累，同時(shí)伴隨有惡性增殖，在血液腫瘤中約占10%[1-2]，MM易出現(xiàn)基因異常，發(fā)生率較高，同時(shí)有獨(dú)立的預(yù)后判斷意義，臨床常用的傳統(tǒng)方法即細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)，其對(duì)基因異常的檢測(cè)率僅占患者的1/3[3-4]，而隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前使用的熒光原位雜交檢測(cè)法，則可以全面對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，避免了傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)的缺陷，提高了基因異常的檢測(cè)率。筆者對(duì)40例多發(fā)性骨髓瘤患者應(yīng)用熒光原位雜交檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2012年3月—2013年12月本院收治的多發(fā)性骨髓瘤患者40例，其中男25例，女15例；年齡37～81(61.8±2.1)歲。多發(fā)性骨髓瘤的診斷依據(jù)2008年中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤工作組制定的《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]。臨床分期主要為ISS分期與DS分期，其中ISS分期中Ⅰ期 8 例，Ⅱ期16例，Ⅲ期16例；DS分期中Ⅰ期 7 例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例。免疫學(xué)分型IgG 型 21例，輕鏈型6例，不分泌型4例，IgA 型9例。選擇同期非血液系統(tǒng)惡性疾病患者16例作為對(duì)照組，其中男10例，女6例；年齡25～66(58.3±1.6)歲。2組患者在年齡、性別等基礎(chǔ)資料比較無(wú)顯著性差異(P均>0.05)。2組患者均簽署參與本試驗(yàn)知情書，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 探針 本文所用熒光原位雜交檢測(cè)試劑盒均出自北京金菩嘉生物公司，其中含有序列特異性探針 1q21，主要針對(duì)1q21 區(qū)帶，此外還含有序列特異性探針RB1即(視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因)以及D13S319，主要針對(duì)13q14 區(qū)帶，還含有序列特異性探針I(yè)GH以及探針p53，分別針對(duì)14q32 區(qū)帶與17p13 區(qū)帶，對(duì)探針做好標(biāo)記，并保存，保存溫度-20 ℃。

1.2.2 處理標(biāo)本 將新鮮的骨髓均勻涂片，不要過(guò)厚，晾干后，行56 ℃烤片處理，處理時(shí)間為10～20 min，再應(yīng)用100%的甲醇浸泡約5 min，使用濃度100%的乙酸浸泡處理30 min，室溫下使用2×SSC液洗片2次，5 min/次，隨后老化玻片約60 min，或者在室溫下過(guò)夜老化玻片，老化好的玻片先后置入37 ℃的RNaseA溶液以及鹽酸胃酶溶液中，孵育時(shí)間分別為30 min與10 min，再行使用2×SSC液洗片2次，5 min/次，隨后在-20 ℃下依次置入到濃度分別為70%，100%和85%的乙醇中行梯度脫水，時(shí)間約2 min，晾干后加熱到56℃，行雜交試驗(yàn)。

1.2.3 原位雜交 探針的配置要在暗室內(nèi)依照檢測(cè)試劑盒的操作進(jìn)行，在70 ℃下，應(yīng)用濃度70%的甲酰胺變性6 min，隨后置入50 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫欣匣幚砗蟮牟Ｆ梢苑胖迷?3 ℃下，使用70%的甲酰胺變性6 min，隨后在-20℃下依次置入到濃度分別為70%，100%和85%的乙醇中行梯度脫水，時(shí)間約3 min，晾干后，再置入50 ℃烤片機(jī)上行預(yù)熱處理約5 min，隨后可將經(jīng)變性后的10 μL 探針滴加入雜交區(qū)，加蓋蓋玻片防止氣泡，在42 ℃下，密封后過(guò)夜，雜交后將玻片置于甲酰胺溶液，2×SSC溶液中洗滌后，于室溫下，置入濃度70%的乙醇中浸泡3 min，在晾干后行DAPI復(fù)染再行封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究所用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS 17.0，對(duì)研究中的計(jì)數(shù)資料行2檢驗(yàn)，使用Spearman相關(guān)系數(shù)分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 涉及探針的陽(yáng)性閥值 16例非血液系統(tǒng)惡性疾病患者，其骨髓樣本間期核細(xì)胞各個(gè)探針陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率見(jiàn)表1。

表1 5種基因探針雜交信號(hào)陽(yáng)性閥值 %

2.2 全部患者探針異常表達(dá)情況 經(jīng)Spearman 相關(guān)分析，p53缺失與lq21 擴(kuò)增呈正相關(guān)(r=0.356,P=0.034)；RB1缺失及D13S319缺失呈正相關(guān)(r=0.855，P=0.001)。見(jiàn)表2。

表2 5種基因探針雜交信號(hào)陽(yáng)性閥值 例(%)

2.3 基因異常與免疫分型及分期情況 基因異常與免疫學(xué)分型及臨床分期關(guān)系，其中D-S分期與IGH重排有相關(guān)性(r=0.425，P=0.001)，ISS分期與p53缺失有相關(guān)性(r=-0.449，P=0.005)，免疫學(xué)分型與D13S319缺失有相關(guān)性(r=-0.341，P=0.040)。其余基因異常與ISS分期以及D-S分期無(wú)顯著相關(guān)性，且與免疫學(xué)分型無(wú)明顯相關(guān)性。

3 討 論

在早期研究中，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的分子細(xì)胞遺傳學(xué)以及細(xì)胞遺傳學(xué)分析，幾乎全部的多發(fā)性骨髓瘤均有克隆性基因異常[6-7]，多為復(fù)雜核型異常，最為常見(jiàn)的是1，13，14及17號(hào)染色體的數(shù)目或者結(jié)構(gòu)異常。本研究中，分別選擇了5種特異性探針，為IGH、D13S319、p53、RB1以及1q21，檢測(cè)后得出異常表達(dá)率較高的RB1缺失、1q21擴(kuò)增、p53缺失以及IGH重排。研究結(jié)果表明，多發(fā)性骨髓瘤患者，其RB1 缺失、1q21 擴(kuò)增、D13S319 缺失、p53 缺失及IGH重排的檢出率分別為35.0%，57.5%，35.0%，22.5%和37.5%，其中1q21 擴(kuò)增發(fā)生率最高，再者為p53 缺失，82.5%患者均存在基因異常，且復(fù)雜核型異常約占60%，因?yàn)閼?yīng)用傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯陽(yáng)性患者僅占1/3。因此使用熒光原位雜交檢測(cè)較傳統(tǒng)方法更加具備優(yōu)勢(shì)，可以顯著提高核型異常的檢出率，同時(shí)證實(shí)多發(fā)性骨髓瘤的核型異常多數(shù)為復(fù)雜核型異常。

1q21區(qū)域存在與多發(fā)性骨髓瘤是聯(lián)系緊密的基因簇，其中主要包括IL-6受體基因，多發(fā)性骨髓瘤會(huì)因IL-6受累，而導(dǎo)致IL-6的數(shù)目基因量的效性大量增加，促使骨髓中的漿細(xì)胞增殖分泌出較多的β2-MG，預(yù)后以及生存期均較差[8-9]。此外，在1q21區(qū)域中還存在CKSlB 基因，其屬于Cks/Sucl 蛋白，可通過(guò)p27K-與Skp2的依賴與非依賴機(jī)制促使多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有所增殖，其也成為了多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后不良因素。

劉珊珊等[10]報(bào)道1q21擴(kuò)增的發(fā)生率為57.5%，與國(guó)外研究相比較高，但與國(guó)內(nèi)的研究報(bào)道幾乎一致，可見(jiàn)國(guó)內(nèi)多發(fā)性骨髓瘤患者的1q21擴(kuò)增發(fā)生比率較高。

而RB1與D13S319是檢測(cè)13q14 缺失的主要相關(guān)部位，13q14 缺失也在多發(fā)性骨髓瘤中有著重要的作用，是反應(yīng)生存期較短的一個(gè)重要指標(biāo)，尤其是并血清β2-MG水平升高的患者，由結(jié)果表明，RB1缺失的檢出率為35%，但RB1缺失與1q21 擴(kuò)增不具有正相關(guān)性，且研究發(fā)現(xiàn)，p53 缺失也并不是多發(fā)性骨髓瘤的特有基因異常，p53 缺失在多發(fā)性骨髓瘤的檢出率為22%，且與ISS分期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(r=-0.449，P=0.005)，由此可見(jiàn)，p53 缺失是多發(fā)性骨髓瘤中較少的繼發(fā)事件，多發(fā)生在ISS期，通過(guò)Spearman相關(guān)性分析，p53缺失與1q21 擴(kuò)增呈正相關(guān)(r=0.356,P=0.034)，與相關(guān)報(bào)道幾乎一致[11]?？梢?jiàn)p53缺失與1q21 擴(kuò)增會(huì)共同參與到激活血管新生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加了骨髓微環(huán)境中的微循環(huán)血量，這也是造成多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病的重要機(jī)制。

本研究D13S319缺失的檢出率是35%，與相關(guān)報(bào)道比較稍低[12]，證實(shí)了免疫學(xué)分型與D13S319缺失有相關(guān)性(r=-0.341，P=0.040)，而IGH檢出率為38%，其與臨床分期D-S分期呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.425，P=0.001)。在本研究中，D-S分期Ⅰ期多發(fā)性骨髓瘤患者，3/7的患者可表達(dá)IGH重排異常，由此說(shuō)明IGH重排是多發(fā)性骨髓瘤基因異常的一個(gè)早期提示事件。

綜上所述，p53缺失、RB1 缺失、1q21 擴(kuò)增及IGH基因的重排是多發(fā)性骨髓瘤常見(jiàn)的復(fù)雜核型異常，前三者是反應(yīng)多發(fā)性骨髓瘤發(fā)展以及預(yù)后的不良因素，應(yīng)用熒光原位雜交檢測(cè)是一種較好的方法，可作為評(píng)估多發(fā)性骨髓瘤的常規(guī)檢查方法，值得臨床予以大量推廣使用。

[1] 楊璐璐，聶玉，劉欣，等. 免疫組織化學(xué)聯(lián)合熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤分子細(xì)胞遺傳學(xué)異常[J/CD]. 中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2013，7(8):3345-3350

[2] 楊瑞芳，李春溟，陳麗娟，等. 熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)MM分子遺傳學(xué)改變及其意義[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2010，27(5)：567-570

[3] 鐘山，余英豪，黃紅浪，等. 熒光原位雜交法對(duì)胃癌組織 HER2 基因狀態(tài)的檢測(cè)[J]. 世界華人消化雜志，2011，19(2):132-137

[4] 王迪，黃亮，張恒，等. FICTION 技術(shù)在檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤遺傳學(xué)異常中的應(yīng)用[J]. 中華血液學(xué)雜志，2011，32(4)：226-230

[5] 唐元艷，梁艷，熊濤，等. 熒光原位雜交技術(shù)與常規(guī)染色體分析檢測(cè)骨髓增生異常綜合征患者+ 8和20q -異常[J]. 臨床薈萃，2012，27(9):761-763

[6] 周麗穎,賈嬋維,余蘭,等. 熒光原位雜交技術(shù)在染色體異常中的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2010,1(4):46-47

[7] Sabattini E，Bacci F，Sagramoso C，et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues in 2008: an overview[J]. Pathologica，2010，102(3):83-87

[8] 宋國(guó)新，李紅芬，李霄，等. 熒光原位雜交與免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃癌組織中HER2基因及蛋白表達(dá)一致性[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28(10):1094-1097

[9] Kawankar N，Rao Vundinti B. Cytogenetic abnormalities in myelodysplasticsyndrome: an overview[J]. Hematology，2011，16(3):131-138

[10] 劉姍姍，彭忠異. HER2 基因在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 實(shí)用癌癥雜志，2012，27(4):339-342

[11] Birerdinc A，Nohelty E，Marakhonov A，et al. Pro-apoptotic andantiproliferative activity of human KCNRG，a putative tumor suppressor in13q14 region[J]. Tumor Biol，2010，31(1)：33-45

[12] 胡林萍，葛菁，張麗艷，等. 用于熒光原位雜交技術(shù)的骨髓細(xì)胞制片方法研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2012，20(2)：496-499

The value of detection of multiple myeloma using fluorescence in situ hybridization gene abnormality

Li Wenbing， Li Xiandong

(Taihe Hospital Afflicted to Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to approach the value of detection by fluorescence in situ hybridization method for multiple myeloma gene abnormality, and further analyzes the characteristics of clinical staging and immunological classification.Methods 40 patients with multiple myeloma were selected to test 5 genes including RB1, 1q21, p53, D13S319 and IGH by fluorescence in situ hybridization, the information of p53 deletion, RB1deletion, amplification of 1q21 gene, and IGH rearrangement were analyzed, and the relationships of abnormal gene with immunological typing and clinical staging of contact were statistics.Results Positive values of RB1, 1q21, p53, D13S319 and IGH were 8.6%, 7.2%, 7.2%, 7.9% and 9.7%. Among 40 patients, 23 cases (58%) were amplified by 1q21, At the same time, detection showed that the deletions of RB1 and D13S319 in 14 cases (35%), 9 cases (22%) of p53 deletion, 15 cases (38%) of IGH gene rearrangement. There were significant correlation between clinical D-S stage and IGH rearrangement (r=0.425,P=0.001), ISS stage and p53 deletion (r=-0.449,P=0.005), immunological classification and D13S319 deletion (r=-0.341,P=0.040).Conclusion For multiple myeloma, the common genetic abnormalities are p53 deletion, RB1 deletion, 1q21 amplification and IGH gene rearrangement. The application of fluorescence in situ hybridization can preferably analyze gene abnormalities and multiple myeloma associated and prognosis, and is worthy of wide popularization and application to clinical.

multiple myeloma; fluorescence in situ hybridization; gene abnormality; detection rate

李文兵，男，主管技師，研究方向?yàn)榕R床檢驗(yàn)。

李顯東，QQ：564494691

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.15.010

R733.3

A

1008-8849(2014)15-1624-03

2013-12-30