哈氏蟲道真菌(Ambrosiella hartigii)生物學特性研究

楊群芳， 李 慶, 蔣春先, 王海建

(四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130)

哈氏蟲道真菌(Ambrosiella hartigii)生物學特性研究

楊群芳*， 李 慶, 蔣春先, 王海建

(四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130)

研究了哈氏蟲道真菌(Ambrosiellahartigii)的生物學特性。結果表明，哈氏蟲道真菌菌絲生長和產(chǎn)孢均以PDA為最佳培養(yǎng)基，菌絲生長以甘露醇為碳源、KNO3為氮源最佳，產(chǎn)孢以蔗糖為碳源、甘氨酸為氮源最佳。菌絲生長和產(chǎn)孢的溫度范圍分別為10～30 ℃和20～30 ℃，最適溫均為25 ℃，最適pH為6。菌絲生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)需要黑暗條件。分生孢子萌發(fā)最適溫度為24～28 ℃，致死溫度為46 ℃10 min，適宜pH為5.0～6.0。分生孢子在水中不萌發(fā)。

Ambrosiellahartigii； 蟲道真菌； 生物學特性

1836年，Schmidberger首次發(fā)現(xiàn)在木質部中蛀坑的小蠹蟲取食坑道壁上排列的連續(xù)的柵欄狀物，而非木質部。對此，他感到非常驚奇和不解，便將這些柵欄狀物稱為 “ambrosia”，意為“神的食物”[1]。1844年，Hartig明確了被北方材小蠹[Xyleborusdispar(Fabricius)]幼蟲取食的柵欄狀物是一種叢梗孢屬(Monilia)真菌，并將這種真菌命名為白亮叢梗孢(MoniliacandidaHartig)(哈氏蟲道真菌Ambrosiellahartigii的異名)[2]。此后，“ambrosia fungi”，即“蟲道真菌”，便主要用于象甲科(Curculionidae)小蠹亞科(Scolytinae)和長小蠹亞科(Platypodinae)中的食菌甲蟲(即“ambrosia beetle”)在坑道中培養(yǎng)、取食的真菌之稱[3-5]。Batra將蟲道真菌分為主要蟲道真菌和輔助性蟲道真菌，其中，主要蟲道真菌是指主要被食菌小蠹幼蟲取食(有時成蟲也取食)，而且由蠹蟲貯菌器儲運的真菌[2]。目前已報道的主要蟲道真菌有蟲道真菌屬(Ambrosiella)、漿霉屬(Ascoidea)、單頂孢屬(Monacrosporium)、Raffaelea、瓶狀霉屬(Phialophoropsis)和樹蛀道菌屬(Dryadomyces)等屬[2,6]，其中，蟲道真菌屬(Ambrosiella)的所有種類均為主要蟲道真菌，全世界已知有10種[2]。

蟲道真菌是一特殊的真菌類群，屬于昆蟲學和真菌學交叉學科的領域，其生物學特性少有研究報道。現(xiàn)已明確，大多數(shù)蟲道真菌有2種生長形式，即具有二型性：蟲道相和菌絲相，蟲道相主要產(chǎn)生大量的分生孢子和芽細胞，菌絲相則表現(xiàn)為大量氣生菌絲生長，很少產(chǎn)孢[2]。蟲道真菌在活坑道和貯菌器中以蟲道相形式生長，在沒有食菌小蠹時或菌種被長期保藏后則以菌絲相形式生長[2,7]。然而，蟲道相在一定的營養(yǎng)條件下仍然能夠得以維持[2]，菌絲相的菌落也可以被誘導再轉化為蟲道相[2]。哈氏蟲道真菌是食菌小蠹—北方材小蠹和光滑足距小蠹[Xylosandrusgermanus(Blandford)]取食的主要蟲道真菌[2,7-9]，也是最早被發(fā)現(xiàn)和最為典型的一種蟲道真菌，其生物學特性的研究僅見于Norris[10]關于該菌在蠹蟲貯菌器內生長時的氮源利用方面，以及Roeper和French[11]關于不同氮源對其生長影響的報道。系統(tǒng)研究哈氏蟲道真菌的生物學特性，對于室內飼養(yǎng)食菌小蠹幼蟲以及進一步揭示蟲菌共生機制等具有重要意義。

1 材料與方法

供試哈氏蟲道真菌自光滑足距小蠹雌成蟲貯菌器內分離所得，菌株由四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)昆蟲學實驗室在PDA斜面上保存于4 ℃冰箱中。接種用的菌絲圓片均為將供試菌在PDA平板上活化后，用打孔器在菌落邊緣切取所得。試驗中每個處理均重復5次。

哈氏蟲道真菌培養(yǎng)4 d后，采用十字交叉法用游標卡尺測量菌落直徑，采用紐鮑爾血球計數(shù)器計測產(chǎn)孢量[12]。

1.1 培養(yǎng)基對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

共設置PDA、YEME、ME、PSA和CMA 5種培養(yǎng)基處理，參考文獻[12]進行配制。每個處理5皿，分別接種菌絲圓片，25 ℃下黑暗培養(yǎng)。

1.2 碳、氮源對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

以改良的葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，配方為：馬鈴薯200 g、碳源20 g、氮源1.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。以蛋白胨為氮源，并以蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、乳糖和甘露醇7種不同碳源取代基礎培養(yǎng)基中的碳源；以葡萄糖為碳源，并以KNO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和甘氨酸7種不同氮源取代基礎培養(yǎng)基中的氮源，以基礎培養(yǎng)基為對照。分別接種菌絲圓片，25 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.3 溫度對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

共設置8、10、15、20、23、25、27、30、35 ℃ 9個溫度處理，分別將菌絲圓片接種于PDA平板上，黑暗培養(yǎng)。

1.4 光照對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

共設置24 h光照、24 h黑暗和12 h光照12 h黑暗3個處理，分別將菌絲圓片接種于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)。

1.5 pH對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

用0.1 mol/L HCl和NaOH調節(jié)PDA培養(yǎng)基pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，共9個處理，分別將菌絲圓片接種于各PDA平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.6 溫度、pH和光照對哈氏蟲道真菌孢子萌發(fā)的影響

采用PDA平板表面萌發(fā)法。將孢子懸浮液均勻涂于PDA平板表面,25 ℃下黑暗培養(yǎng)，每6 h鏡檢1次，統(tǒng)計萌發(fā)率。

共設置12、16、20、24、28、32 和36 ℃ 7個溫度處理，每處理設5皿，黑暗培養(yǎng)。分別于24 h和36 h后統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

用0.1 mol/L HCl和NaOH調節(jié)PDA培養(yǎng)基pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，共8個處理，25 ℃黑暗培養(yǎng)。36 h后統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

共設置24 h光照、24 h黑暗和12 h光照12 h黑暗3個處理，25 ℃恒溫培養(yǎng)。分別于24 h和 36 h后統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

1.7 哈氏蟲道真菌孢子致死溫度的測定

取10 mL孢子懸浮液(孢子濃度為10×10倍下每視野50～100個左右孢子)于滅菌試管中，分別于36、38、40、42、44、46、48、50、60 ℃等不同溫度處理10 min后，用玻棒涂于PDA平板表面，25 ℃黑暗培養(yǎng)。36 h后鏡檢統(tǒng)計孢子萌發(fā)率，以孢子不萌發(fā)最低溫度處理為致死溫度。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

培養(yǎng)基對哈氏蟲道真菌菌絲生長和產(chǎn)孢影響很大。菌絲生長和產(chǎn)孢均以PDA培養(yǎng)基最好，其次是PSA，最差是CMA，在CMA上幾乎不產(chǎn)孢(表1)。

此外，在PDA和PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲極少，表面具有白色孢子層的面積大；而在YEME和ME培養(yǎng)基上，菌落呈截然不同的2部分，以接種點為圓心，內圓為孢子區(qū)，距邊緣約2 cm的圓環(huán)上為豐富的氣生菌絲。在CMA培養(yǎng)基上，菌絲極為稀疏，極少氣生菌絲。

表1 培養(yǎng)基對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響1)Table 1 Effects of media on mycelium growth and sporulation of A. hartigii

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值，同列數(shù)據(jù)后字母不同者，表示鄧肯氏檢驗差異極顯著(P<0.01)。下同。
Data are mean±SE.Different letters in the same column indicate significant difference by Duncan test at 0.01 level. The same below.

2.2 碳源對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

碳源對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢有顯著影響。哈氏蟲道真菌菌絲生長以甘露醇最好，其次是蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和乳糖，淀粉和CK最差；產(chǎn)孢以蔗糖、甘露醇、葡萄糖和可溶性淀粉為好，其中以蔗糖最好，乳糖和CK最差(表2)。

表2 碳源對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響Table 2 Effects of carbon sources on mycelial growth and sporulation of A. hartigii

2.3 氮源對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

氮源對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢存在極顯著影響。哈氏蟲道真菌菌絲生長以KNO3最好，其次是甘氨酸，牛肉膏最差，在CK上菌絲生長較快，但菌絲極為稀疏;產(chǎn)孢以甘氨酸最好，其次是蛋白胨和(NH4)2SO4，牛肉膏和酵母粉最差(表3)。

2.4 溫度對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

哈氏蟲道真菌菌絲在10～30 ℃范圍內可以生長，低于10 ℃或高于35 ℃時不能生長。在10～25 ℃范圍內，菌絲生長隨著溫度的升高而加快，當溫度為25 ℃時，菌絲生長最快。溫度為10 ℃時菌絲生長最差，幾乎不生長(表4)。

哈氏蟲道真菌在20～30 ℃范圍內可以產(chǎn)孢，溫度≤15 ℃或≥35 ℃時不能產(chǎn)孢。溫度為25 ℃時，產(chǎn)孢量最大，極顯著高于其他溫度處理，溫度為30 ℃時產(chǎn)孢最差(表4)。

表4 溫度對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響Table 4 Effects of temperature on mycelial growth and sporulation of A. hartigii

2.5 光照對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

光照對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢有抑制作用。24 h黑暗處理菌絲生長最佳，產(chǎn)孢量最大，極顯著高于12 h光暗交替處理。24 h光照處理菌絲幾乎不生長，也不產(chǎn)孢(表5)。

表5 光照對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響Table 5 Effects of light on mycelial growth and sporulation of A. hartigii

2.6 pH對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的pH范圍為4～10。在pH 4～10范圍內，隨著pH的增大，菌絲生長速度先增大后減??；當pH為6時，菌絲生長最快，pH為4～6時，產(chǎn)孢量最大。而pH≤3或≥11的條件下，菌絲生長不佳，也不產(chǎn)孢(表6)。

表6 pH對哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響Table 6 Effects of pH value on mycelial growth and sporulation of A. hartigii

2.7 溫度、pH和光照對哈氏蟲道真菌孢子萌發(fā)的影響

分生孢子萌發(fā)的溫度范圍為16～32 ℃，最適24～28 ℃，低于16 ℃或高于32 ℃孢子基本不能萌發(fā)。在12～32 ℃范圍內，分生孢子萌發(fā)率隨溫度升高而逐漸增大，當溫度為28 ℃時，分生孢子萌發(fā)率為55.7%，達到最大值。溫度高于28 ℃時，孢子萌發(fā)率隨溫度的升高而減小(圖1)。

圖1 溫度對哈氏蟲道真菌孢子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of temperature on conidial germination of A.hartigii

25 ℃時，分生孢子12 h才有極少數(shù)開始萌發(fā)(約1%)，24 h萌發(fā)率為20%左右，36 h 萌發(fā)率可達86%，48 h萌發(fā)率達97%(圖2)。

圖2 時間對哈氏蟲道真菌孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of time on conidial germination of A.hartigii

分生孢子萌發(fā)的適宜pH為5～6，pH高于10時，孢子基本不萌發(fā)。除了pH為5、6這2個處理之間分生孢子的萌發(fā)率差異不顯著外，其余各pH處理有極顯著差異。以pH為5、6這2個處理的孢子萌發(fā)率較高，達60%，pH為10時分生孢子萌發(fā)率最低(圖3)。

圖3 pH對哈氏蟲道真菌孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effects of pH value on conidial germination of A. hartigii

光照對哈氏蟲道真菌分生孢子萌發(fā)有抑制作用。連續(xù)光照條件下，孢子不萌發(fā)；光照、黑暗12 h交替下分生孢子萌發(fā)率顯著低于24 h黑暗的處理(圖4)。

圖4 光照對哈氏蟲道真菌孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effects of light on conidial germination of A. hartigii

2.8 哈氏蟲道真菌孢子的致死溫度

分生孢子在44 ℃10 min的萌發(fā)率為4.5%，46 ℃10 min以及高于46 ℃各處理溫度的分生孢子萌發(fā)率為0，說明哈氏蟲道真菌分生孢子的致死溫度為46 ℃10 min。

3 結論與討論

生物學特性的研究是真菌重要的基礎研究。筆者系統(tǒng)地研究了哈氏蟲道真菌菌絲生長及產(chǎn)孢的培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH和光照條件，以及分生孢子的萌發(fā)條件，為哈氏蟲道真菌分離培養(yǎng)及其蟲菌共生相關研究積累了基礎資料。雖然YEME和ME培養(yǎng)基較適合蟲道真菌生長[2]，但本文研究結果表明，哈氏蟲道真菌菌絲生長和產(chǎn)孢在PDA平板上仍然較在YEME和ME平板上好。此外，在培養(yǎng)哈氏蟲道真菌時還應該注意其分生孢子在水中不能萌發(fā)的特性。

食菌小蠹與蟲道真菌是互惠共生的關系[2,11]，蟲菌共生機制一直是食菌小蠹研究領域的一個熱點，而研究蟲道真菌的生物學特性有助于揭示蟲菌共生機制。Norris研究表明，哈氏蟲道真菌在蠹蟲貯菌器內是利用蠹蟲體液中的可溶性氨基酸，特別是L-脯氨酸為氮源進行生長的[10]。早期有學者認為，蠹蟲排泄的尿酸和尿囊素可能會成為坑道中蟲道真菌生長的氮源。1981年，Roeper和French通過不同氮源對哈氏蟲道真菌生長影響的研究表明，哈氏蟲道真菌并不能利用蠹蟲排泄的尿酸和尿囊素為氮源進行生長，而以氨基酸為氮源時生長最好[11]。本文結果進一步表明，哈氏蟲道真菌不但以氨基酸為氮源時生長好，而且產(chǎn)孢也最好。光滑足距小蠹和北方材小蠹是歐洲和亞洲最重要的林木和果樹害蟲[13-16]，其幼蟲和成蟲僅取食蟲道真菌，幼蟲主要取食蟲道真菌的孢子[9, 17]。本文研究結果表明，光照對哈氏蟲道真菌菌絲生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)均有抑制作用，菌絲生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)都需要黑暗條件。這是哈氏蟲道真菌長期適應寄主木質部坑道中黑暗環(huán)境條件的結果。也正是由于光照對哈氏蟲道真菌菌絲生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)的抑制作用，寄主坑道一旦遭到破壞，坑道中的蟲道真菌便會停止生長，很快消亡[18]。

溫度是影響昆蟲生長發(fā)育最為重要的因素。本文研究結果表明，25 ℃是哈氏蟲道真菌菌絲生長和產(chǎn)孢的最適溫度，27 ℃時菌絲生長變慢，產(chǎn)孢減少，因此，盡管光滑足距小蠹幼蟲生長發(fā)育的最適溫度為26.44 ℃[19]，但是為了保障其食物—哈氏蟲道真菌生長和產(chǎn)孢最佳，室內飼養(yǎng)蠹蟲時溫度條件仍以25 ℃為佳。

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BiologicalcharacteristicsofAmbrosiellahartigii,anambrosiafungus

Yang Qunfang, Li Qing, Jiang Chunxian, Wang Haijian

(CollegeofAgronomy,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

The biological characteristics ofAmbrosiellahartigiiwere studied. The results showed thatA.hartigiicould produce many spores and grow very well on the PDA and PSA media. The mannitol and KNO3were the best carbon and nitrogen sources for mycelial growth, respectively, while sucrose and glycine was favorable for conidial formation. The mycelium could grow between 10-30 ℃, while the conidia could form between 20-30 ℃. For mycelial growth and sporulation, the optimum temperatures and pH were 25 ℃ and 6.0, respectively. The mycelial growth, sporulation and conidial germination all required darkness. For conidial germination, the optimum temperature was 24-28 ℃, at pH 5.0-6.0, and the lethal temperature was 46 ℃(10 min). The conidia could not germinate in water.

Ambrosiellahartigii； ambrosia fungus； biological characteristics

2013-12-31

：2014-04-02

四川省科技廳應用基礎項目(2006J13-040)

Q 965

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.018

* 通信作者 E-mail:lmk94811 @163.com