白 甫，朱麗紅，柳小莉，唐志書，郭東艷

(陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

花生衣為豆科植物落花生(ArachishypogaeaL.)的種皮，味甘、微苦、性平，具有健脾和胃、養(yǎng)血止血、散瘀消腫之功。主要含有脂質(zhì)、鞣質(zhì)、甾醇、花生苷、花生衣色素、兒茶素等成分[1]，其中主要色素成分為黃酮類化合物，另外還含有花色苷、黃酮、二氫黃酮等?，F(xiàn)代藥理研究表明，花生衣的95% 乙醇總提物對(duì)正常小鼠及凝血障礙小鼠均有明顯的止血作用[2]。此外花生衣還具有抗纖維蛋白溶解、促進(jìn)骨髓制造血小板、縮短出血時(shí)間、加強(qiáng)毛細(xì)血管的收縮、調(diào)整凝血因子缺陷等功能[3]。臨床觀察結(jié)果表明花生衣湯能提高化療周期患者的血紅蛋白[4]、顯著提高肝硬化患者的血小板數(shù)[5]及具有防止化療引起血小板降低的作用[6]。近年來廣泛用于胃、腸、肺、子宮等內(nèi)臟出血，及放化療引起的血小板減少癥等。但是查閱大量文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，有關(guān)花生衣總黃酮純化工藝研究較少，因此本文擬采用大孔樹脂純化法對(duì)花生衣總黃酮的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，為后期進(jìn)一步制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料 花生衣購(gòu)于西安盛興中藥飲片有限公司，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤老師鑒定為豆科植物落花生(ArachishypogaeaL.)的種皮；蘆丁對(duì)照品(中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)100080-200707),水為雙蒸餾水，試劑均為分析純；D101型大孔樹脂、HPD300型大孔樹脂、HPD100型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂(西安藍(lán)曉科技有限公司)。

1.2 儀器 WJN-50多功能真空濃縮機(jī)(韓國(guó))，L-520型離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)有限公司)，RE-52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),SB3200DT-超聲波清洗機(jī)(寧波)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在105 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加20 mL甲醇，超聲處理溶解，再用甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(0.20 mg/mL)，放入冰箱備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密移取樣品液1 mL至50 mL量瓶中,加50%甲醇至刻度。精密吸取0.5 mL至25 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 總黃酮的最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)掃描，掃描范圍200～800 nm，結(jié)果均在510 nm處有強(qiáng)吸收峰。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液2，3，4，5，6，7 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，參照紫外-可見分光光度法(附錄ⅤA)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 得回歸方程Y=11.339X-0.035，R2=0.999 7，結(jié)果表明蘆丁在0.016～0.056 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 樣品中總黃酮含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液1 mL，加水至6.0 mL，按2.1.4項(xiàng)下加5%亞硝酸鈉溶液1 mL起，至在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記錄吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

2.2 樹脂型號(hào)的篩選

2.2.1 母液的制備 稱取花生衣1 kg，加15倍量40%乙醇提取3次，每次30 min,濾過合并提取液，濃縮，回收乙醇至無(wú)醇味，加蒸餾水定容至2 000 mL，備用。

2.2.2 樣品溶液的制備 取母液100 mL，加蒸餾水定容至250 mL，制成濃度為0.2 g/mL樣品。

2.2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 用95%的乙醇浸泡24 h，蒸餾水洗至無(wú)醇味，備用。

2.2.4 靜態(tài)吸附 將經(jīng)過預(yù)處理的4種大孔樹脂(D101、HPD100、HPD300、AB-8)去除表面水后，各取3 g，分別置于具塞錐形瓶中，再分別移取0.2 g/mL的樣品溶液50 mL加入裝有樹脂的具塞錐形瓶中，振搖8 h，靜置16 h，過濾，得殘留液。測(cè)定總黃酮含量A1。樹脂加入50%的乙醇50 mL,振搖8 h，靜置16 h，過濾，得到洗脫液，測(cè)定總黃酮含量A2。

2.2.5 液殘留液及洗脫液中總黃酮的測(cè)定 母液中總黃酮的測(cè)定：取1 mL樣品溶液，用甲醇定容至25 mL，取出0.4 mL，加入顯色劑，定容至25 mL。測(cè)定母液中的總黃酮含量A3,結(jié)果見表1。

未被吸附的殘留液中與洗脫液中總黃酮含量的測(cè)定：精密吸取殘留液與洗脫液各1 mL，用甲醇定容至25 mL，取出0.8 mL加顯色劑定容至25 mL。測(cè)定其殘留液中總黃酮含量A1，洗脫液中總黃酮含量A2，結(jié)果見表1。

吸附率=[(母液含量A3(mg)-殘留液中總黃酮含量A1(mg))/母液含量A3(mg)]×100%

解析率=[40%乙醇洗脫下的含量A2/(母液含量A3(mg)-殘留液中含量A1(mg))]×100%

表1 靜態(tài)吸附考察結(jié)果

結(jié)果表明:AB-8型大孔樹脂的吸附量、解吸量低于其他3種型號(hào)樹脂，D101的吸附率及解吸率較大，故選擇D101樹脂。

2.3 樹脂純化條件的考察[7-8]

2.3.1 徑高比的選擇 分別稱取預(yù)處理過的D101大孔樹脂2.4，4.8，7.2，9.6 g,使徑高比分別為1∶5,1∶10,1∶15,1∶20。樹脂生藥比為1∶1。分別取適量的樣品溶液稀釋至濃度為0.1/mL,加于D101樹脂柱上，以3 BV/h的流速進(jìn)行吸附，先以4 BV水洗脫后，再用4BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，測(cè)定水洗液和醇洗液中總黃酮的含量,計(jì)算吸附率及洗脫率。結(jié)果當(dāng)徑高比為1∶15時(shí),花生衣的吸附率和洗脫率均最大，因此，確定樹脂柱的徑高比為1:15。

2.3.2 上樣藥液濃度的選擇 稱取預(yù)處理過的D101大孔樹脂4份，每份7.2 g，使徑高比為1∶15。樹脂生藥比為1∶1，分別取適量的樣品溶液,將樣品溶液分別稀釋為含生藥0.1,0.2,0.3,0.4 g/mL,(原本考察的濃度為0.2，0.4，0.6，0.8 g/mL，但由于濃度到0.4 g/mL時(shí)。柱子有些堵，所以將濃度范圍定為0.1，0.2，0.3，0.4 g/mL)，加于D101樹脂柱上，以3 BV/h的流速進(jìn)行吸附后，先以4 BV/h水洗脫后，再用4 BV/h 70%乙醇洗脫，收集洗脫液至，計(jì)算吸附率及洗脫率。結(jié)果見表2。

表2 上樣藥液濃度的考察結(jié)果

在從表中可以看出上樣藥液濃度為0.1 g/mL時(shí)，花生衣中總黃酮的吸附率和洗脫率均最大，因此，確定上樣液的藥液濃度為0.1 g/mL。

2.3.3 上樣藥液流速的考察 稱取D101樹脂7 g 4份，分別裝柱，徑高比為1∶15，取0.1 g/mL的藥液50 mL 4份。將4份樣品分別按照0.5,1,2,3 BV/h的流速上樣，統(tǒng)一按照50 mL水洗量，2 BV/h水洗流速進(jìn)行水洗除雜,70%乙醇洗脫至鹽酸鎂粉反應(yīng)無(wú)色。分別收集洗脫，取1 mL用甲醇定容至25 mL，精密量取0.8 mL，加顯色劑定容至25 mL。結(jié)果見表3。

表3 上樣藥液流速考察結(jié)果

結(jié)果表明：上樣流速對(duì)有效成分的吸附有顯著的影響，在2 BV/h的條件下有效成分含量最大，故確定上樣流速為2 BV/h。

2.3.4 水洗大孔樹脂的考察 取已經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂7.2 g裝柱(1.1 cm×15 cm，V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL)藥液上樣后靜置2 h,以流速為2 BV/h的水除去水溶性雜質(zhì)。以15 mL為單位收集洗脫液，洗至無(wú)顏色。以鹽酸鎂粉反應(yīng)陰性作為水洗終點(diǎn)，最終確定洗脫用水用量約3 BV。

2.3.5 洗脫劑濃度的確定 取已經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂裝柱(1.1 cm×15 cm,V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL)。藥液上樣后靜置2 h，用3 BV水洗去雜質(zhì)后,依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液各3 BV進(jìn)行梯度解吸，分段收集解吸液。測(cè)定并計(jì)算解吸液中黃酮的含量，繪制解吸曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 洗脫劑濃度考察結(jié)果

由圖可以看出，黃酮在60%時(shí)基本解析完畢，但由于在解吸的過程中乙醇會(huì)揮發(fā),所以選擇70%的乙醇為洗脫劑。

2.3.6 洗脫劑用量的考察 取已經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂裝柱(1.1 cm×15 cm，V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL生藥)藥液上樣后靜置2 h，用3 BV水洗去雜質(zhì)后，用70%乙醇進(jìn)行洗脫，每1 BV收集1份，測(cè)定洗脫液中總黃酮的含量，繪制解析曲線。結(jié)果見圖2。

圖2 洗脫液用量考察試驗(yàn)結(jié)果曲線

結(jié)果表明：當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到3 BV時(shí)，洗脫液中的黃酮含量已很低。所以選擇洗脫劑用量為3 BV。

2.4 花生衣大孔樹脂的工藝參數(shù)驗(yàn)證 按照優(yōu)選的工藝條件，選用D101型大孔樹脂，上樣藥液濃度為0.1 g/mL，上樣速度為2 BV/h，樹脂徑高比為1∶15，洗脫時(shí)先用3 BV水洗，再用3 BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥，計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果總黃酮平均含量為66.12%(n=3)。表明該純化工藝穩(wěn)定、合理、可行。

3 結(jié)論

大孔樹脂吸附法是近年來中藥及天然藥物純化工藝中應(yīng)用較為廣泛的一種方法。由于其價(jià)格便宜，可重復(fù)使用，且所得到的的純化物色澤較淺，吸濕性降低，特備適宜于中藥提取液的分離純化。故本文采用其對(duì)花生衣的總黃酮進(jìn)行純化精制，為后期制劑成型奠定基礎(chǔ)。

本文通過建立紫外-可見分光光度法對(duì)花生衣總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，通過D101型大孔吸附樹脂對(duì)總黃酮分離富集條件進(jìn)行了優(yōu)化優(yōu)化，確定了其分離富集條件。經(jīng)純化后花生衣總黃酮純度達(dá)到66.12%，分離效果良好該工藝具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),具有較好的推廣應(yīng)用。

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