牽張刺激對乳大鼠心房肌細胞瞬時外向鉀電流和內(nèi)向整流鉀電流的影響*

胥亞楠， 楊 龍,△， 楊天和， 鄧春玉， 羅 淋， 覃智芳， 唐 倩， 楊 君

(1貴陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽 550002； 2遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義 563003； 3廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080)

心房顫動(房顫)常高發(fā)于有高血壓、心力衰竭(心衰)等基礎(chǔ)疾病的患者[1]。此類基礎(chǔ)疾病促使心房容量或壓力負荷增加，對心房肌產(chǎn)生牽張刺激，促進心房重構(gòu)[2]。心房肌細胞離子通道重構(gòu)是電重構(gòu)的基礎(chǔ)。對房顫離子通道重構(gòu)的研究涉及多種離子通道的表達和功能改變。瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current,Ito)和內(nèi)向整流鉀電流(inward rectifier potassium current,IK1)是參與心肌細胞動作電位(action potential, AP)復(fù)極相1、3期的主要離子流，其電流大小明顯影響AP 1、3相時程。本研究通過體外牽張模型拉伸培養(yǎng)的心房肌細胞，應(yīng)用膜片鉗全細胞記錄方法探討牽張刺激對Ito、IK1及動作電位時程(action potential duration, APD)的影響。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶(Gibco),Ⅱ型膠原酶(Invitrogen),辣根過氧化酶抗兔抗體(Santa Cruz),封閉專用脫脂奶粉(普利萊公司),4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI； Biobox),硅膠膜購于SMI,5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine, 5-BrdU)、4-氨基吡啶(4-amion pyridine, 4-AP)、兔抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白(a-sarcomeric actin, α-SCA) 抗體和環(huán)孢素A(cyclosporine A, CsA)購自于Sigma，其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

記錄鉀電流的細胞外液(mmol/L)：NaCl 136.0、KCl 5.4、MgCl2·6H2O 1.0、NaH2PO40.33、CaCl2·2H2O 2.0、HEPES 10.0和葡萄糖10.0，pH用NaOH調(diào)至7.4。記錄Ito時，在細胞外液中加入0.3 mmol/L CdCl2和0.5 mmol/L BaCl2分別阻斷L-型鈣電流(ICa-L)和IK1。記錄IK1時，在細胞外液中加入0.5 mmol/L 4-AP和1 μmol/L尼卡地平分別阻斷Ito和ICa-L。鉀電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 140、MgCl2·6H2O 1.0、HEPES 10.0、EGTA 5.0、Na2·ATP 5.0，pH用KOH調(diào)至7.2。記錄動作電位的電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 140、MgCl2·6H2O 1.0、HEPES 10.0、EGTA 0.05、Na2·ATP 5.0，pH用KOH調(diào)至7.2。含鈣臺氏液(mmol/L)：NaCl 136、KCl 5.4、NaH2PO40.33、葡萄糖10.0、HEPES 10.0和CaCl2·2H2O 2，pH用NaOH調(diào)至7.4[3]。

2 動物與儀器

1 日齡SD乳鼠每組9只，由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供，雌雄不限，許可證號為[SCXK(粵)2011-0029]。倒置顯微鏡(ZEISS AXIO型)。電極拉制儀(Narishige PP830型)。膜片鉗放大器(Axopatch700B)及附件均為Axon產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1乳鼠心房肌細胞分離與培養(yǎng) 分離乳鼠心房并剪碎。以含胰酶與Ⅱ型膠原酶的混合消化液消化6 ～ 7 min，取上層細胞懸液于10% FBS-DMEM中終止消化。重復(fù)消化、終止過程，直至組織塊完全消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加適量完全培養(yǎng)基，制成細胞懸液。采用差速貼壁與BrdU結(jié)合，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中純化培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液洗去未貼壁細胞與成纖維細胞，換含5%血清培養(yǎng)基進行下一步實驗[4]。

3.2心房肌細胞免疫熒光染色鑒定 細胞爬片培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛室溫固定60 min，PBS洗3遍，每次5 min。5% BSA室溫封閉30 min后，加Ⅰ抗兔抗大鼠α-SCA抗體(1∶50)4 ℃過夜，PBS洗3遍，每次5 min。加Ⅱ抗羊抗兔IgG-FITC (1∶100)，37 ℃ 60 min。PBS洗3遍，復(fù)染細胞核，加入封片劑封片后，于熒光顯微鏡下觀察并攝片[4]。以乳大鼠心臟成纖維細胞作為陰性對照。

3.3細胞牽張刺激 采用靜態(tài)等雙軸牽張裝置對心房肌細胞施加定量力學(xué)拉伸。牽張刺激可使細胞肥大、蛋白/DNA比值增大。本課題前期實驗中，給予培養(yǎng)24 h的心房肌細胞增加12%硅膠膜面積牽張刺激24 h，細胞蛋白質(zhì)/DNA比值增大，證實了牽張刺激的有效性[5]。

3.4細胞干預(yù)分組 細胞培養(yǎng)于牽張裝置24 h，更換5% FBS-DMEM培養(yǎng)基。對照組不予牽張刺激；牽張組予以增加12%硅膠膜面積牽張刺激培養(yǎng)24 h。

3.5心房肌細胞Ito和IK1測定 預(yù)溫0.125%胰酶消化心房肌細胞，制成單細胞懸液。于直徑35 mm培養(yǎng)皿中調(diào)整細胞數(shù)使其密度約為1×102，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2～3 h使細胞貼壁。選擇立體感強、大小適中的細胞進行實驗。玻璃微電極充灌電極液后電阻為2～4 MΩ。施加負壓使電極與細胞表面形成1 GΩ以上高阻抗封接。破膜，給予慢電容補償，形成全細胞記錄。設(shè)置鉗制電壓為-50 mV，給予指令電位-40 mV～+60 mV，步階電壓10 mV，波寬300 ms，頻率0.2 Hz的刺激，記錄Ito。記錄IK1時，將鉗制電壓設(shè)置為-40 mV，指令電壓-120 mV～+30 mV，步階電壓10 mV，波寬500 ms，頻率0.1 Hz。為避免細胞大小所造成的誤差采用電流密度分析，電流密度(pA/pF)=電流強度/電容。電流信號經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗AXON 700B放大器放大通過AD/DA轉(zhuǎn)換板，并存儲于計算機硬盤中。實驗由pCLAMP 10.0軟件程序刺激發(fā)放和信號采集。

3.6心房肌細胞AP測定 AP記錄同膜片鉗全細胞記錄Ito和IK1相似。區(qū)別在于采用細胞貼附技術(shù)，形成高阻封接后破膜，不予補償。并應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)中的電流鉗模式，給予1 nA電流脈沖，波寬5 ms，引發(fā)心房肌細胞AP。記錄并分析靜息膜電位(resting membrane potential, RMP)和動作電位幅度(action potential amplitude, APA)和動作電位復(fù)極50%、90%時程(APD50、APD90)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用pCLAMP 10.0軟件進行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，運用SigmaPlot軟件繪制離子通道電流密度-電壓曲線。用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳大鼠心房肌細胞鑒定

由乳鼠心房組織分離、純化培養(yǎng)48 h的細胞，有95%為 α-SCA抗體免疫熒光染色陽性(圖1A)，而成纖維細胞為陰性(圖1B)，表明前者為心房肌細胞。

Figure 1. α-SCA antibody immunofluorescence staining of atrial myocytes.A: the left picture is cultured for 48 hours of atrial myocytes of rabbit anti α-SCA antibody immunofluorescence staining, green is positive (×200); the right one is the same vision for nuclear with DAPI (×200)； B: the results of cardiac fibroblasts stained under the same condition of atrial myocytes.

2 牽張對乳大鼠心房肌細胞Ito的影響

2組心房肌細胞Ito在-20 mV激活，電流密度隨去極化程度增加而增大，于+60 mV達最大值。與對照組相比，牽張組Ito峰值從+20 mV電壓開始顯著減小，且牽張組Ito的I-V曲線明顯下移，見圖2。在+60 mV鉗制電壓水平，對照組與牽張組電流密度分別為(12.1±2.9)pA/pF 和(1.6±0.4)pA/pF(P<0.01)。

Figure 2. Current density-voltage curve of Ito in neonatal rat atrial myocytes. Mean±SD.n=9. **P<0.01 vs control group.

3 牽張刺激對乳大鼠心房肌細胞IK1的影響

在-90 mV～-120 mV鉗制電壓水平，牽張組較對照組電流密度明顯增大，在-120 mV鉗制電壓水平，IK1幅度達到最大，此電壓下對照組與牽張組平均電流密度分別為(-8.8±0.9)pA/pF和(10.8±0.8)pA/pF(P<0.01)。圖3顯示IK1的內(nèi)向整流特性。

4 牽張對乳大鼠心房肌細胞AP的影響

與對照組相比,牽張組心房肌細胞RMP無明顯差異，APA降低，APD50和APD90縮短，動作電位形態(tài)變窄,見圖4、表1。

討 論

房顫病因繁多，隨著基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致心房壓力負荷不斷增大，心房肌受到牽張刺激隨之增大。壓力負荷促使心肌肥大[6]，增加基質(zhì)金屬蛋白酶活性[7]，離子通道相應(yīng)基因的表達也發(fā)生變化，心房發(fā)生重構(gòu)[6,8]。

Ito和IK1分別在AP 1期和3期復(fù)極中起著重要作用。房顫患者心房肌細胞Ito密度降低[9]，IK1密度增大[10]，APD縮短，這些改變正是心房重構(gòu)的電生理特點之一，也可能是促進房顫發(fā)生和維持的機制之一[11]。本研究結(jié)果顯示，牽張組心房肌細胞Ito電流密度從+20 mV開始顯著減小，且與對照組相比Ito的I-V曲線明顯下移。與王德勝等[9]對房顫患者心房肌細胞研究不同的是，Ito電流密度在+20 mV～+60 mV顯著下降，而在較低電壓下對照組和牽張組相比電流密度無顯著差異。出現(xiàn)上述差異可能因Ito在不同種屬表達的差異性。另外，在-120 mV鉗制電壓水平，牽張刺激促進IK1增大。

Figure 3. Current density-voltage curve of IK1 in neonatal rat atrial myocytes. Mean±SD.n=9. ** P<0.01 vs control group.

Figure 4. Action potential of neonatal rat atrial myocytes.A: a cell of control group; B: a cell of stretched group.

表1 2組動作電位相關(guān)參數(shù)比較

AP產(chǎn)生的原因主要是由于細胞膜兩側(cè)帶電離子的不均衡分布，以及在不同情況下細胞膜對一些離子的通透性發(fā)生改變所致。因此，AP是由多種離子通道共同參與決定。本研究結(jié)果顯示牽張組APD50和APD90明顯縮短，APA降低，證實牽張刺激促進心房肌細胞電重構(gòu)。包括心房肌細胞Ito和IK1在內(nèi)的多種離子通道電流發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞膜離子通透性變化，影響跨膜離子流，共同導(dǎo)致APD縮短和APA降低。

本研究通過細胞牽張模型，模擬心房負荷過重對心房產(chǎn)生的機械力學(xué)作用，反映心房負荷增加對細胞離子通道的影響，為心房電重構(gòu)和房顫疾病發(fā)生機制提供一定的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

[參 考 文 獻]

[1] Heeringa J, van der Kuip DA, Hofman A, et al. Prevalence, incidence and lifetime risk of atrial fibrillation: the Rotterdam study[J]. Eur Heart J, 2006, 27(8):949-953.

[2] Kim SJ, Choisy SC, Barman P, et al. Atrial remodeling and the substrate for atrial fibrillation in rat hearts with elevated afterload[J]. Circ Arrhythm Electrophysiol, 2011, 4(5):761-769.

[3] 鄧春玉, 唐承靜, 鄺素娟, 等. 燈盞花素對大鼠心室肌細胞瞬間外向和內(nèi)向整流鉀電流的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(1):84-88.

[4] 羅 淋, 劉志琴, 楊 龍, 等. 大鼠乳鼠原代心房肌細胞培養(yǎng)的方法及鑒定[J]. 國際心血管病雜志, 2013, 40(2):112-115.

[5] 楊 龍, 何炯紅, 袁正強, 等. 替米沙坦抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶調(diào)控牽張刺激誘導(dǎo)乳鼠心房肌細胞Cav1.2 mRNA的表達[J]. 貴州醫(yī)藥, 2011, 35(9):771-775.

[6] Saygili E, Rana OR, Saygili E, et al. Losartan prevents stretch-induced electrical remodeling in cultured atrial neonatal myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(6):H2898-H2905.

[7] Saygili E, Rana OR, Meyer C, et al. The angiotensin-calcineurin-NFAT pathway mediates stretch-induced up-regulation of matrix metalloproteinases-2/-9 in atrial myocytes[J]. Basic Res Cardiol, 2009, 104(4):435-448.

[8] De Jong AM, Maass AH, Oberdorf-Maass SU, et al. Cyclical stretch induces structural changes in atrial myocytes[J]. J Cell Mol Med, 2013, 17(6):743-753.

[9] 王德勝, 黃從新, 鄭 文, 等. 心房顫動心房肌細胞短暫外向鉀電流的特點[J]. 中國心臟起搏與心電生理雜志, 2001, 1(52):89-91.

[10] 薛玉梅, 吳書林, 鄧春玉, 等. 心房顫動患者內(nèi)向整流性鉀電流及Kir2.1 mRNA表達水平的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2005, 21(4):707-710.

[11] Wijffels MC, Kirchhof CJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: a study in awake chronically instrumented goats[J]. Circulation, 1995, 92(7):1954-1968.