香煙煙霧提取物通過蛋白激酶C-核因子相關(guān)因子2調(diào)節(jié)大鼠氣道上皮細(xì)胞血紅素加氧酶1表達(dá)

江 剛， 張衛(wèi)東

(湖南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 長沙 410005)

氧化應(yīng)激機(jī)制是引起慢性阻塞性肺疾病(chro-nic obstructive pulmonary disease，COPD)的主要發(fā)病機(jī)制之一。香煙煙霧中含有大量的氧自由基和活性氧，引起細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化失衡，吸煙是引起COPD的主要危險(xiǎn)因素。紅系衍生的核因子相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是氧化還原反應(yīng)感受器，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下調(diào)節(jié)抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶如谷氨酰半胱氨酸合成酶、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)的表達(dá)，避免細(xì)胞損傷[1-3]。HO-1是血紅素代謝的限速酶,具有抗氧化損傷、抗炎癥反應(yīng)及細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。近來研究表明，蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信號(hào)通路參與Nrf2激活及其對抗氧化基因的調(diào)節(jié)，其是否參與香煙煙霧誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)尚待進(jìn)一步研究[4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)誘導(dǎo)大鼠氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，使用PKC抑制劑及Nrf2 siRNA，觀察Nrf2、PKC和HO-1蛋白的表達(dá)情況，以及Nrf2的核轉(zhuǎn)位變化，進(jìn)一步探討PKC-Nrf2-HO-1通路在大鼠氣道上皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激機(jī)制中的作用，及其在 COPD中可能參與的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與動(dòng)物

白沙牌香煙(湖南白沙卷煙廠)；胎牛血清(天津?yàn)?；細(xì)菌蛋白酶ⅩⅣ(Sigma)；蛋白提取液(Pierce);異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶聯(lián)的抗大鼠抗體和FITC偶聯(lián)的抗兔抗體(北京中杉金橋)；p-PKC抗體(Cell Signaling)；RO318220、HO-1抗體和Nrf2多克隆抗體(Santa Cruz)；熒光顯微鏡(IX-70型，Olympus；中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)；凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海Tanon Gis-2010)；病理圖文分析系統(tǒng)PAS9000(無錫朗珈生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)。

雄性清潔級(jí)SD大鼠25只，體重180～200 g，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。

2 方法

2.1SD大鼠氣道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及分組 參照Wu等[6]方法，將雄性SD大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，分離氣管，D-Hanks液反復(fù)沖洗其內(nèi)膜面，在管腔內(nèi)注滿150 mg/L的細(xì)菌蛋白酶ⅩⅣ，結(jié)扎兩端后4 ℃冰箱過夜；取出氣管，剪開氣管兩端，用含20 %胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基沖洗氣管內(nèi)膜面，收集細(xì)胞懸液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用上述培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，待氣道上皮細(xì)胞80%融合時(shí)，分別取1×106個(gè)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.2細(xì)胞分組 將25只SD大鼠的氣道上皮細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、CSE 3 h組、PKC抑制劑RO318220組、Nrf2 siRNA組和Nrf2 siRNA+RO318220組，每組5只。CSE 3 h組為含10%CSE的DMEM/F12培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 h；PKC抑制劑RO318220組則加入CSE前0.5 h加入3 μmol/L RO318220抑制劑；Nrf2 siRNA組為加入CSE前加入Nrf2 siRNA；Nrf2 siRNA+RO318220組為加入CSE前加入3 μmol/L RO318220抑制劑及Nrf2 siRNA。

2.3CSE的制備 參照Vayssier-Taussat等[7]方法，將白沙牌香煙點(diǎn)燃，其過濾嘴端接1根橡皮管，橡皮管的另一端接注射器。點(diǎn)燃香煙，模擬人實(shí)際吸煙狀況，每分鐘吸1次，每次30 mL，持續(xù)2 s，共收集10管300 mL煙霧，注入含10 mL DMEM玻璃瓶中，搖動(dòng)玻璃瓶使煙霧充分溶解制成懸液。懸液用1 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.4，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后稀釋10倍制成含10% CSE及10%胎牛血清培養(yǎng)基。制備的CSE在30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

2.4siRNA轉(zhuǎn)染 Nrf2的siRNA序列由上海吉瑪生物(Genepharma)合成，Nrf2 siRNA正義鏈5’-AGAUUUAGAUCAUUUGAAATT-3’，反義鏈5’-UUUCAAAUGAUCUAAAUCUTG-3’；陰性對照siRNA正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。取1×105氣道上皮細(xì)胞接種在6孔板上，待細(xì)胞匯合達(dá)到80%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用250 μL Opti-MEM? I分別稀釋5 μL LipofectamineTM2000和7.5 μL siRNA，輕輕混勻并孵育5 min，然后混合稀釋的siRNA和LipofectamineTM2000，輕輕混合并孵育20 min，將siRNA - LipofectamineTM2000復(fù)合物加入到每一個(gè)包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24～48 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70%以上。

2.5免疫細(xì)胞化學(xué)染色 采用鏈霉親和素蛋白-過氧化物酶法,按以下步驟進(jìn)行：將爬有SD大鼠氣道上皮細(xì)胞的蓋玻片經(jīng)常規(guī)4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100穿透細(xì)胞，3% H2O2處理封閉內(nèi)源性過氧化氫酶活性，加正常山羊血清消除非特異性反應(yīng)，然后滴加Ⅰ抗，加生物素化Ⅱ抗，加鏈霉親和素和3，3’-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、觀察，陽性結(jié)果呈棕黃色。陰性對照片以PBS代替Ⅰ抗進(jìn)行孵育。結(jié)果觀察：各組隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算機(jī)自動(dòng)測量并計(jì)算陽性信號(hào)積分吸光度(IA)值, 取平均值作為各實(shí)驗(yàn)組陽性表達(dá)的相對強(qiáng)度。

2.6細(xì)胞免疫熒光染色 Ⅰ抗為兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體，Ⅱ抗為FITC標(biāo)記的抗兔抗體，操作步驟同免疫細(xì)胞化學(xué)，熒光顯微鏡下觀察熒光的表達(dá)部位。

2.7Western blotting檢測 PBS漂洗細(xì)胞2次，刮下細(xì)胞至1.5 mL EP管中，按Pierce蛋白提取液操作說明書提取胞漿蛋白和核蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。樣品分裝，貯存-80 ℃待用。每份樣本上樣200 μg，經(jīng)恒壓SDS-PAGE，用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，0.65 mA/cm恒流電泳，室溫，2.5 h,室溫封閉3 h后，按0.1 mL/cm膜面積加入1∶1 000 稀釋的Ⅰ抗雜交，4 ℃過夜,封閉液漂洗后按0.1 mL/cm膜面積加入1∶2 000 稀釋的Ⅱ抗，室溫下?lián)u床孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，X線膠片顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)對所得條帶吸光度半定量，計(jì)算待測條帶的吸光度與內(nèi)參照吸光度比值。

2.8RT-PCR檢測 采用Trizol、氯仿/異丙醇法提取細(xì)胞中總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。大鼠HO-1上游引物5’-CTTTCAGAAGGGTCAGGTGTCCA-3’，下游引物5’-CTGAGAGGTCACCCAGGTAGCGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為309 bp。PCR反應(yīng)條件為94 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃ 60 s，32個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，其上游引物5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’,下游引物5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為450 bp。取8 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，用Bio-Rad Gel Doc 2000型凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，所測擴(kuò)增條帶積分光密度值用內(nèi)參照修正。

2.9HO-1活性測定 根據(jù)HO-1降解血紅素生成膽紅素和一氧化碳的原理，測定樣品反應(yīng)物中膽紅素生成量可代表HO-l的活性[8]。取1×106個(gè)細(xì)胞,用含20 mmol/L Tris-HCl和Triton X-100緩沖液漂洗，然后4 ℃、15 000×g離心15 min，收集上清液，加入含2 mmol/L MgCl2、2.75 mmol/L NADPH、1×103U/L肝膽綠素還原酶和1 mmol/L正鐵血紅素200 μL中，置37 ℃暗處1 h，之后加入氯仿1 mL 終止反應(yīng)。以不含NADPH的樣品作空白對照，樣品與空白均做雙份，在分光光度計(jì)上用400 nm和650 nm雙波長測定膽紅素生成量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,多個(gè)樣本比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞免疫熒光觀察Nrf2蛋白的表達(dá)位置

細(xì)胞免疫熒光顯示在正常對照組Nrf2蛋白主要分布在大鼠氣道上皮細(xì)胞胞漿中。在CSE 3 h組，Nrf2蛋白集中分布在氣道上皮細(xì)胞胞核中，其表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示Nrf2蛋白由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位。當(dāng)預(yù)先給予PKC抑制劑RO318220，Nrf2蛋白主要位于大鼠氣道上皮細(xì)胞胞漿，而胞核未見明顯顯現(xiàn)，提示RO318220抑制Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位，見圖1。

Figure 1. The protein expression of Nrf2 in the rat airway epithelial cells detected by immunofluorescence. A: control group (×200); B: CSE 3 h group (×200); C: RO318220 group (×100).

2 Western blotting檢測各組PKC、HO-1和Nrf2蛋白的表達(dá)

Western blotting法檢測結(jié)果顯示Nrf2胞漿蛋白在對照組和RO318220組表達(dá)增強(qiáng)，在CSE 3 h組、RO318220抑制劑組、Nrf2 siRNA組及Nrf2 siRNA+RO318220組表達(dá)均明顯減弱(P<0.05)。Nrf2胞核蛋白和HO-1蛋白在CSE 3 h組表達(dá)明顯強(qiáng)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在RO318220組、Nrf2 siRNA組及Nrf2 siRNA+RO318220組表達(dá)均減弱，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。p-PKC蛋白在CSE 3 h組和Nrf2 siRNA組較對照組表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P<0.05)，在RO318220組和Nrf2 siRNA+RO318220組表達(dá)降低，與對照組比較均無顯著差異(P>0.05),見圖2。

Figure 2. The protein expression of nuclear Nrf2, cytoplasmic Nrf2, HO-1 and p-PKC in the rat airway epithelial cells determined by Western blotting. The corresponding β-actin was showed as the loading control.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs CSE 3 h group.

3 免疫細(xì)胞化學(xué)觀察各組HO-1蛋白的變化

HO-1蛋白主要表達(dá)在大鼠氣道上皮細(xì)胞胞漿中，在對照組其胞漿弱陽性表達(dá)，在CSE 3 h組其胞漿呈強(qiáng)陽性表達(dá)；在RO318220組、Nrf2 siRNA組和RO318220+Nrf2 siRNA組其胞漿弱陽性表達(dá)，與CSE 3 h組比較差異顯著(P<0.05)，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

Figure 3. The protein expression of HO-1 in the rat airway epithelial cells detected by immunocytochemistry (×200). A: control group; B: CSE 3 h group; C: Nrf2 siRNA group; D: RO318220 group; E: RO318220+Nrf2 siRNA group.

4 RT-PCR檢測各組HO-1 mRNA表達(dá)水平

HO-1 mRNA水平在CSE 3 h組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在RO318220組、Nrf2 siRNA組及RO318220+Nrf2 siRNA組HO-1 mRNA均低表達(dá)，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但明顯低于CSE 3 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The mRNA expression of HO-1 in the rat airway epithelial cells determined by RT-PCR. The correspon-ding GAPDH was showed as the loading control.Mean±SD.n=5. *P<0.05 vs control group.

5 各組HO-1活性

HO-1活性在CSE 3 h組為(2.34±0.16) nmol·(g protein)-1·h-1，明顯高于對照組(0.75±0.07)nmol·(g protein)-1·h-1。在RO318220組、Nrf2 siRNA組和Nrf2 siRNA+RO318220組，HO-1活性分別下降到(0.78±0.07)、(0.82±0.10)和(0.76±0.07)nmol·(g protein)-1·h-1，明顯低于CSE 3 h組(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

HO-1是血紅素代謝的限速酶，催化血紅素分解為一氧化碳、鐵和膽綠素。HO-1位于非神經(jīng)組織中，具有抗氧化損傷、抗炎癥反應(yīng)和細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，在氧化應(yīng)激、硝化應(yīng)激、巰基化物質(zhì)及細(xì)胞因子等作用下誘導(dǎo)表達(dá)。香煙煙霧中含有大量的自由基和活性氧，通過氧化應(yīng)激引起肺損傷，而氣道上皮細(xì)胞和肺泡細(xì)胞內(nèi)抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶如HO-1過表達(dá)以對抗損傷。研究證明槲皮素增加HO-1表達(dá)，避免過氧化氫誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷[9]。本研究表明，大鼠氣道上皮細(xì)胞暴露CSE 3 h后，HO-1蛋白在大鼠氣道上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)明顯增強(qiáng)，HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)，HO-1活性增強(qiáng),說明CSE通過氧化應(yīng)激上調(diào)大鼠氣道上皮細(xì)胞HO-1表達(dá)。

Nrf2屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子，具有保護(hù)細(xì)胞避免內(nèi)源性及外源性應(yīng)激。Keap1是Nrf2的主要抑制因子，和Nrf2構(gòu)成氧化應(yīng)激的關(guān)鍵感受器，在氧化應(yīng)激時(shí)通過與抗氧化基因如谷氨酰半胱氨酸合成酶、HO-1、醌氧化酶1等基因的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)結(jié)合，調(diào)節(jié)抗氧化基因的表達(dá)。近來研究發(fā)現(xiàn)，HO-1誘導(dǎo)劑姜黃素通過Nrf2與HO-1的ARE結(jié)合，上調(diào)HO-1表達(dá)。甘菊通過提高Nrf2磷酸化水平和核轉(zhuǎn)位，與HO-1的ARE結(jié)合,提高HO-1表達(dá)水平[10]。同型半胱氨酸通過Nrf2調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞HO-1表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠氣道上皮細(xì)胞暴露CSE 3 h后，Nrf2蛋白由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位，其胞核蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，胞漿蛋白明顯降低，HO-1活性、mRNA和蛋白水平明顯升高。然而，使用siRNA敲除Nrf2，明顯抑制了Nrf2胞漿和胞核蛋白表達(dá)，而且顯著抑制了HO-1活性、mRNA和蛋白水平。這表明Nrf2的激活及其核轉(zhuǎn)位在CSE調(diào)節(jié)H抗氧化基因O-1的表達(dá)中具有非常重要作用。

研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和PKC信號(hào)通路參與激活Nrf2，引起Nrf2核轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)抗氧化基因的表達(dá)[1, 4, 6]。PKC信號(hào)通路通過磷酸化Nrf2 (Ser40)，使Nrf2與Keap1分離，從而調(diào)節(jié)抗氧化基因表達(dá)。Zhang等[12]對離體兔心臟缺血再灌注的研究中發(fā)現(xiàn)，PKC誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)HO-1的抗氧化防御能力。Quesada等[13]研究表明力生長因子24參與激活PKCε-Nrf2，上調(diào)HO-1表達(dá)，保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞避免6-羥多巴胺引起的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠氣道上皮細(xì)胞暴露CSE 3 h后，PKC蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Nrf2蛋白出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，HO-1活性、mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)。然而，預(yù)先加入RO318220，抑制Nrf2核轉(zhuǎn)位，其胞漿蛋白水平增強(qiáng)，胞核蛋白水平減弱，且HO-1活性明顯降低，其mRNA及蛋白表達(dá)明顯減弱。預(yù)先給予Nrf2 siRNA，Nrf2胞漿和胞核蛋白、HO-1活性、mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而PKC蛋白表達(dá)增強(qiáng)。同時(shí)加入RO318220和Nrf2 siRNA，PKC蛋白和HO-1活性、mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低。這表明PKC參與Nrf2核轉(zhuǎn)位及HO-1上調(diào)表達(dá)。然而，Lee等[14]對人臍靜脈上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，非瑟酮通過PKC-δ和p38 MAPK信號(hào)通路激活Nrf2活性，引起Nrf2核轉(zhuǎn)位，與HO-1的ARE結(jié)合,上調(diào)HO-1表達(dá),從而對抗過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。鵝掌菜酚通過ERK和 PI3K/Akt信號(hào)通路激活Nrf2，上調(diào)HO-1表達(dá)，降低氧化應(yīng)激對中國地鼠肺纖維細(xì)胞的損傷[15]。這表明誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的信號(hào)通路在不同誘導(dǎo)劑和不同細(xì)胞種類之間具有差異。所以，PI3K/Akt和MAPK是否參與香煙煙霧誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位和HO-1表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。

本研究證明CSE引起大鼠氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激；通過PKC信號(hào)通路激活Nrf2，誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，上調(diào)HO-1表達(dá)，可維持細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化平衡。因此，對PKC-Nrf2-HO-1信號(hào)通路的進(jìn)一步研究有助于更加深入了解COPD氧化/抗氧化發(fā)病機(jī)制，為尋找一種新的調(diào)節(jié)Nrf2抗氧化藥物在COPD治療中提供理論研究基礎(chǔ)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Boutten A, Goven D, Artaud-Macari E, et al. NRF2 targeting: a promising therapeutic strategy in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Trends Mol Med, 2011, 17(7):363-371.

[2] 劉曉燕，戴愛國，譚雙香. 慢性阻塞性肺疾病中轉(zhuǎn)錄因子ATF3/ATF4與Nrf2的表達(dá)及相互作用[J]. 中國病理生理雜志，2011，27(10):1961-1966.

[3] 吳 露，黃小平，鄧常清，等. 人參皂苷R g1對小鼠腦缺血再灌注后腦組織損傷及Nrf2/HO-1途徑的影響[J]. 中國病理生理雜志，2013，29(11):2066-2071.

[4] Yun BR, Lee MJ, Kim JH, et al. Enhancement of parthenolide-induced apoptosis by a PKC-alpha inhibition through heme oxygenase-1 blockage in cholangiocarcinoma cells[J]. Exp Mol Med, 2010, 42(11):787-797.

[5] Lee SE, Yang H, Jeong SI, et al. Induction of heme oxygenase-1 inhibits cell death in crotonaldehyde-stimulated HepG2 cells via the PKC-δ-p38-Nrf2 pathway[J]. PLoS One, 2012, 7(7): e41676.

[6] Wu R, Nolan E, Turner C. Expression of tracheal diffe-rentiated function in serumfree hormone-supplemented medium[J]. J Cell Physiol, 1985, 125(2): 167-181.

[7] Vayssier-Taussat M, Camilli T, Aron Y, et al. Effect of tobacco smoke and benzo[a]pyrene on human endothelial cell and monocyte stress response[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001, 280(3): H1293-H1300.

[8] Zhou JL, Ling YL, Jin GH, et al. Endogenous carbon monoxide attenuates lung injury following ischemia-reperfusion in the hind limbs of rats[J]. Acta Physiol Sin, 2002, 53(3):229-233．

[9] Hayashi Y, Matsushima M, Nakamura T, et al. Quercetin protects against pulmonary oxidant stress via heme oxygenase-1 induction in lung epithelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 417(1):169-174.

[10] Bhaskaran N, Shukla S, Kanwal R, et al. Induction of heme oxygenase-1 by chamomile protects murine macrophages against oxidative stress[J]. Life Sci, 2012, 90(25-26):1027-1033.

[11] Mani M,Golmohammadi T,Khaghani S,et al. Homocysteine induces heme oxygenase-1 expression via transcription factor Nrf2 activation in HepG2 cell[J]. Iran Biomed J, 2013, 17(2):93-100.

[12] Zhang X, Xiao Z, Yao J, et al. Participation of protein kinase C in the activation of Nrf2 signaling by ischemic preconditioning in the isolated rabbit heart[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 372(1-2):169-179.

[13] Quesada A, Ogi J, Schultz J, et al. C-terminal mechano-growth factor induces heme oxygenase-1-mediated neuroprotection of SH-SY5Y cells via the protein kinase Cε/Nrf2 pathway[J]. J Neurosci Res, 2011, 89(3):394-405.

[14] Lee SE, Jeong SI, Yang H, et al. Fisetin induces Nrf2-mediated HO-1 expression through PKC-δ and p38 in human umbilical vein endothelial cells[J]. J Cell Biochem, 2011, 112(9):2352-2360

[15] Kim KC, Kang KA, Zhang R, et al. Up-regulation of Nrf2-mediated heme oxygenase-1 expression by eckol, a phlorotannin compound, through activation of Erk and PI3K/Akt[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(2):297-305.