白藜蘆醇通過PI3K/Akt通路及線粒體途徑抑制軟骨肉瘤*

金海東, 戴 兵, 蔡建武, 陳 輝, 范時洋, 潘 駿

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，浙江 溫州 325000)

軟骨肉瘤(chondrosarcoma)是常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于長管狀骨及髂骨，晚期可以發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，在骨腫瘤中，其發(fā)病率僅次于骨肉瘤。隨著醫(yī)療技術(shù)迅速發(fā)展，近年來惡性骨腫瘤的診斷和治療有了很大的進(jìn)步，患者治療后的長期生存率也有了明顯提高，但是軟骨肉瘤的治療依然是一個挑戰(zhàn)，特別是對于微小病灶，手術(shù)不能切除病灶，或者對放化療不敏感或耐藥時。因此，尋找敏感高效低毒的抗腫瘤藥物是治療軟骨肉瘤的迫切問題。白藜蘆醇(resveratrol，Res)作為一種天然的藥物，屬于非黃酮類多酚化合物，具有多種生物學(xué)活性如抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、調(diào)控細(xì)胞凋亡、雌激素調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等活性[1]。研究證明白藜蘆醇對多種腫瘤包括肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞等均有一定抗癌性[2-4]。鑒于PI3K/Akt信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，而國內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇對軟骨肉瘤的影響，本研究以軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞為研究對象，采用白藜蘆醇處理腫瘤細(xì)胞后，觀察其對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及PI3K/Akt信號通路的影響，探討白藜蘆醇防治軟骨肉瘤的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和試劑

軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。白藜蘆醇和Hoechst 33258購自Sigma-Aldrich；抗Bcl-2、Bax、Akt和p-Akt的抗體購自Cell Signaling Technology；抗activated caspase-3的抗體購自Bioworld；CCK8試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將SW1353細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每3 d傳代。用含EDTA胰蛋白酶消化，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將細(xì)胞以1×106的密度接種在60 mm的培養(yǎng)板，分加藥組(100 μmol/L)和對照組，藥物處理24 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3CCK8法測定細(xì)胞活性和增殖 實(shí)驗(yàn)分空白組、對照組(不加藥)和藥物組(25 μmol/L 組、50 μmol/L組和100 μmol/L 組)，各組細(xì)胞均在37 ℃共同孵育24 h和48 h，按照試劑盒說明書，每孔加CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)37 ℃溫育1 h后，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞活力(%)=(A加藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

2.4Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡 調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L接種于6孔板內(nèi)的任意4個孔，每孔500 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌2遍，每孔加入Hoechst 33258染色液染色20～30 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)。

2.5Western blotting檢測 用RIPA細(xì)胞裂解液和超聲裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000×g離心20 min 后收集總蛋白，并計(jì)算出上樣體積。變性后SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，然后加入抗activated caspase-3、Bcl-2、Bax、Akt和p-Akt抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，應(yīng)用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光，以β-actin蛋白作為內(nèi)參照。在凝膠成像儀下曝光，用Image Lab軟件分析。

2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 6孔板每孔加入約5×105個細(xì)胞，次日用槍頭每隔0.5～1 cm垂直劃線，PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h取樣，拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 白藜蘆醇對SW1353細(xì)胞形態(tài)的影響

100 μmol/L白藜蘆醇處理軟骨肉瘤SW1353后，顯微鏡觀察可見細(xì)胞與細(xì)胞分離，三角形形態(tài)雜亂無規(guī)律，而對照組瘤細(xì)胞則呈密集規(guī)律三角形排列，見圖1。

Figure 1. The effect of resveratrol (Res) on the morphological of SW1353 cells (×100). SW1353 cells were treated with 100 μmol/L Res for 24 h and the morphological changes were observed under microscope. A: control; B: 100 μmol/L Res.

2 白藜蘆醇抑制軟骨肉瘤細(xì)胞的活力

隨著作用時間增加，白藜蘆醇對細(xì)胞活力的抑制作用增大，反映出對SW1353細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。不同劑量的白藜蘆醇處理細(xì)胞后均出現(xiàn)細(xì)胞活力的下降，見圖2。25、50和100 μmol/L Res作用24 h，其細(xì)胞活性分別為0.5789±0.1379、0.5287±0.0842和0.4944±0.0819(P<0.01)作用48 h后，其活性分別為0.3750±0.1006、0.3947±0.0587和0.3126±0.0571(P<0.01)。24 h與48 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 2. The effect of resveratrol (Res) on the viability of SW1353 cells. Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs untreated cells (not shown); #P<0.05 vs 24 h.

3 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡的情況

Hoechst 33258染色后凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)核皺縮，熒光染料濃聚，呈亮藍(lán)色，或呈致密濃染核碎裂，圖3染色可見25、50和100 μmol/L白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡多于未加藥的對照組。

4 白藜蘆醇作用于線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡

25、50和100 μmol/L Res作用軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞24 h、48 h和72 h，Western blotting檢測線粒體途徑的凋亡蛋白表達(dá)情況，與對照組相比，加藥組的activated caspase-3和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。100 μmol/L Res作用后activated caspase-3和Bax蛋白表達(dá)最高， Bcl-2表達(dá)最低。而24 h、48 h和72 h組間差異不明顯，但與 0 h相比較，activated caspase-3和Bax蛋白表達(dá)增加， Bcl-2蛋白表達(dá)下降，見圖4。

Figure 3. The apoptosis of SW1353 cells determined by Hoechst 33258 staining after resveratrol (Res) treatment (×200). A: control; B～D: 25， 50 and 100 μmol/L Res.

Figure 4. The effect of resveratrol (Res) on related mitochondrial protein expression in SW1353 cells. A,B: the protein levels of activated caspase-3, Bcl-2, Bax in the cells treated with different concentrations of Res; C, D: the protein levels of actived-caspase-3, Bcl-2, Bax in the cells exposed to 50 μmol/L Res in different time points.

5 白藜蘆醇抑制PI3K/Akt信號通路

25、50和100 μmol/L Res作用軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞24 h、48 h和72 h，Western blotting結(jié)果顯示(圖5)，p-Akt蛋白隨著時間延長，表達(dá)呈減弱趨勢，72 h其表達(dá)最弱。不同濃度的藥物處理，p-Akt也出現(xiàn)不同程度的降低(100 μmol/L組最弱)，但是總Akt蛋白表達(dá)在時間和劑量因素改變下均未見明顯的變化。

Figure 5. The effect of resveratrol (Res) on PI3K/Akt signaling pathway in SW1353 cells. A: the protein levels of Akt and p-Akt in the cells treated with different concentrations of Res; B: the protein levels of Akt and p-Akt in the cells exposed to 50 μmol/L Res in different time points.

6 白藜蘆醇能抑制軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞的遷移

0、50和100 μmol/L Res處理肉瘤細(xì)胞，圖6可見藥物處理后劃痕區(qū)域細(xì)胞少見，而對照組可見許多細(xì)胞遷移到劃痕區(qū)域。0、50和100 μmol/L Res 作用24 h后其相關(guān)的劃痕寬度比率分別為0.8390±0.1151、0.9640±0.0816和1.0525±0.0919(P<0.01)，而48 h后其劃痕寬度比率分別為0.7890±0.1678、0.9404±0.1153和1.0317±0.1018。

討 論

白藜蘆醇最早是在1940年從毛葉黎蘆根部獲得的[6]，現(xiàn)在從葡萄、花生、決明和虎杖中均能提取到白藜蘆醇[7]，其中新鮮的葡萄皮中含量最高，約達(dá)50～100 mg/g。從白藜蘆醇發(fā)現(xiàn)至今，其在腫瘤領(lǐng)域研究較多，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)包括肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞等[2-5]癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖和轉(zhuǎn)移，起到抗腫瘤作用，但是其抗腫瘤的作用機(jī)制有不同程度的差異。

國內(nèi)外很多學(xué)者研究證實(shí)白藜蘆醇能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，如Li等[8]用白藜蘆醇處理肝癌細(xì)胞，能抑制高糖環(huán)境下腫瘤的增殖；Bhardwaj等[9]將白藜蘆醇處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能抑制其增殖，下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax，激活caspase-3誘導(dǎo)凋亡。由于國內(nèi)外無文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇對軟骨肉瘤的影響，因此本研究用不同濃度的白藜蘆醇處理軟骨肉瘤細(xì)胞12 h、24 h和48 h，發(fā)現(xiàn)能抑制軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖，同時發(fā)現(xiàn)activated caspase-3蛋白(17 kD)的表達(dá)增強(qiáng)。Activated caspase-3蛋白是procaspase-3在凋亡發(fā)生時裂解的2個小片段(17 和19 kD)。同時還發(fā)現(xiàn)凋亡的相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)下降，Bax的表達(dá)增強(qiáng)。這些結(jié)果均與白藜蘆醇對其它腫瘤的抑制效果相似。我們認(rèn)為白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)軟骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。Bcl-2和Bax是線粒體調(diào)節(jié)凋亡的重要分子，外界刺激因素使線粒體的通透性改變，引起細(xì)胞色素C等小分子的釋放，Bcl-2、Bcl-xL等下調(diào)，Bax上調(diào)，進(jìn)而使caspase家族出現(xiàn)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10-11]。上述研究結(jié)果表明白藜蘆醇誘導(dǎo)軟骨肉瘤細(xì)胞的凋亡是通過線粒體途徑發(fā)揮作用的。

Figure 6. The cell migration determined by wound scratch assay (×100). Mean±SD. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs 0 μmol/L.

在信號通路研究領(lǐng)域，已經(jīng)證實(shí)人類多種腫瘤如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等中，PI3K和Akt的過表達(dá)和異常激活參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-14]，PI3K/Akt信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。PI3K存在于細(xì)胞周期延續(xù)、細(xì)胞分化、生存、侵入及擴(kuò)散，它的生物活性是通過調(diào)節(jié)下游靶分子Akt而體現(xiàn)出來的。Akt 的磷酸化水平可以作為衡量PI3K活性的指標(biāo)，同時反映PI3K信號通路的活性。從本研究的結(jié)果(圖5)我們看到不同濃度的白藜蘆醇能夠使Akt的磷酸化顯著降低，而總Akt未見明顯改變，可見白藜蘆醇抑制軟骨肉瘤作用，部分是通過抑制PI3K/Akt信號通路發(fā)揮效應(yīng)。同時Akt信號通路又能影響其下游線粒體途徑中Bcl-2和Bax的表達(dá)，表明PI3K/Akt信號通路和線粒體途徑存在相互作用，共同促進(jìn)軟骨肉瘤細(xì)胞凋亡，抑制瘤細(xì)胞的增殖和生長。

綜上所述，白藜蘆醇誘導(dǎo)軟骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖，部分是通過PI3K/Akt通路及線粒體途徑，但其通路中的上下游分子參與凋亡調(diào)控或是否還影響其它通路途徑，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。目前認(rèn)為白藜蘆醇能激活Sirt1[15]，但是其促進(jìn)凋亡、影響這兩條途徑是否與Sirt1有關(guān)聯(lián)？尚需更加深入探索。另外我們證實(shí)了白藜蘆醇能夠抑制瘤細(xì)胞的遷移(圖6)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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