周期性牽張應力對人椎間盤纖維環(huán)細胞合成和分解的影響*

范東偉 陳仲強 郭昭慶 齊 強 李危石

臨床研究

周期性牽張應力對人椎間盤纖維環(huán)細胞合成和分解的影響*

范東偉 陳仲強△郭昭慶 齊 強 李危石

目的探討不同牽張應力對體外培養(yǎng)的人椎間盤纖維環(huán)細胞合成和分解代謝的影響。方法采用Flexercell Strain Unit對人椎間盤纖維環(huán)細胞施加不同拉伸幅度的周期性牽張應力，通過Real-time PCR，蛋白印跡法，免疫組化以及阻斷劑等方法，檢測細胞合成代謝基因（collagen-1A1，collagen-2A1，aggrecan，versican）和分解代謝基因（MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，ADAMTS-5）在周期性牽張應力下椎間盤纖維環(huán)細胞中的表達。結(jié)果合成代謝基因中collagen-1A1和collagen-2A1在12%的應力條件下較對照組表達升高，collagen-2A1在18%表達下降，分解代謝基因MMP-13和ADAMTS-5在12%和18%的應變下較對照組表達升高，ADAMTS-4表達隨應力拉伸幅度升高而表達增強。ERK1/2的阻斷劑U0126，能明顯阻斷應力誘導的ADAMTS-4的表達，而p38和JNK的阻斷劑SP6000125和SB203580阻斷應力誘導ADAMTS-4表達作用不明顯。結(jié)論不同拉伸幅度的牽張應力對椎間盤纖維化細胞的生物學行為的影響不同，其結(jié)果可以影響椎間盤的退變。

骨折，應力性；椎間盤；信號傳導；椎間盤細胞；ADAMTS-4；ERK

應力是導致椎間盤退變的重要原因之一[1]。應力作用于椎間盤細胞，影響椎間盤細胞代謝，從而影響椎間盤功能。椎間盤通過分解代謝基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、解整鏈蛋白金屬蛋白酶（ADAMTS）-4、ADAMTS-5和合成代謝基因，如聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Ⅰ型膠原（collagen-1A1）、Ⅱ型膠原（collagen-2A1）、硫酸軟骨素蛋白聚糖（versican），來調(diào)節(jié)椎間盤的分解與合成代謝，維持椎間盤的穩(wěn)態(tài)[2]。然而，應力調(diào)節(jié)細胞代謝的機制目前還不十分清楚。本研究應用Flexercell細胞應變加載裝置對體外培養(yǎng)的人椎間盤纖維環(huán)細胞施加確定頻率、不同幅度和時間的周期性張力應變，觀察人椎間盤纖維環(huán)細胞的合成與分解代謝基因的表達變化以及MAPK信號通路的調(diào)控影響，為進一步了解機械力對椎間盤細胞的影響及其分子機制提供資料。

1 材料與方法

1.1 細胞牽張裝置及其他主要設(shè)備和試劑 Equi-Biaxial牽張裝置及原理見文獻[3]。Olympus倒置相差顯微鏡，Theroma CO2孵箱，胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)。

1.2 標本取材、細胞分離與培養(yǎng) 標本取材經(jīng)過北京大學第三醫(yī)院倫理委員會批準，取自5例臨床脊柱創(chuàng)傷患者，女3例，男2例，平均年齡43歲。術(shù)中取椎間盤纖維環(huán)組織，做細胞培養(yǎng)。將剪成小塊的纖維環(huán)組織均勻貼附于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使貼壁的組織塊懸空，靜置8 h后，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，加入少量培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM)內(nèi)，12 h后再次加入培養(yǎng)基完全覆蓋組織塊，置37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)；待組織塊周圍有大量細胞遷出后，去除脫落的組織塊，3～5 d更換培養(yǎng)液。當細胞生長至培養(yǎng)皿底80%時，用PBS液清洗2次，用原裝Hyclone胰酶消化液(含0.25%胰酶，0.02%EDTA)37℃消化細胞2～4 min；以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中將細胞吹打成單細胞懸液，以1∶2的比例進行細胞傳代培養(yǎng)。同法，將細胞懸液800 r/min離心5 min，棄去上清，細胞沉淀在含90%胎牛血清、10%DMSO的溶液內(nèi)凍存，-80℃3 d后，轉(zhuǎn)至液氮保存。

1.3 細胞周期性張應變加載 計數(shù)消化好的細胞，按1×105個/孔接種于6孔Bio-Flex培養(yǎng)板(Flexcell International，USA)底的硅膠膜上；每孔加2 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，次日換成無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。采用Flexcell細胞應變加載系統(tǒng)(Flexercell FX-4000T strain unit，F(xiàn)lexcell International，USA)對細胞施加周期性張應變。該系統(tǒng)由計算機控制臺、真空泵和置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)的加載基臺組成，將接種細胞后的6孔Bio-Flex培養(yǎng)板置于基臺并密封，由真空泵以一定的頻率抽吸真空引起培養(yǎng)板的硅膠膜變形，由此引起黏附于硅膠膜上的細胞發(fā)生相應的變形，即對細胞加載了相應的周期性張應變。周期性張力應變的頻率、牽張幅度和加載時間均由計算機控制。加載方案：幅度分別為6%(6%組)，12%(12%組)和18%(18%組)，時間均為24 h，頻率均為0.2 Hz，以未加載的靜態(tài)細胞作為對照組，實驗重復8次。

1.4 Real-time PCR檢測 牽張應力作用24 h后收細胞。應用Trizol(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取細胞總RNA。使用Superscript first-strand synthesis system反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1條鏈。ABI SYBR Real-time PCR試劑盒。反應條件：95℃5 min，然后95℃15 s，60℃30 s，40個循環(huán)。所有操作均嚴格按照說明書進行。表達引物見表1。β-actin引物同F(xiàn)an等[4]的設(shè)計，北京奧科公司合成。檢測基因均屬于椎間盤細胞內(nèi)表達的基因。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測 用2倍蛋白裂解液提取細胞蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測ADAMTS-4的表達量，用β-actin作為內(nèi)參。按比例稀釋一抗：anti-ADAMTS-4抗體，1∶300(Santa Cruz，USA)；β-actin 抗體，1∶1 000(Santa Cruz Technologies，USA)；圖像掃描后，用Alpha Imager 2200(Alpha Innotech)軟件進行圖像灰度分析。

1.6 信號通路的研究 為了明確是ERK1/2、p38還是JNK信號通路在張力應變過程中發(fā)揮作用，采用ERK1/2信號通路

Table 1 PCR primers used to detect gene expression表1 用于檢測基因表達的引物序列

2 結(jié)果

2.1 牽張應力對椎間盤細胞基因表達的影響 和對照組相比，12%組、18%組aggrecan基因表達減少，collagen-1A1和collagen-2A1在12%組較對照組略有升高，collagen-2A1在18%組較對照組表達降低。versican表達各組間差異無統(tǒng)計學意義。6%組、12%組、18%組ADAMTS-4基因隨著牽張應力的增加而表達增加，而MMP-13和ADAMTS-5在12%和18%組較對照組升高，6%組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義。MMP-3表達各組間差異無統(tǒng)計學意義，見圖1。

2.2 各信號通路ADAMTS-4基因表達情況 Realtime PCR結(jié)果顯示，ERK1/2信號通路的阻斷劑U0126可以顯著阻斷牽張應力誘導的ADAMTS-4 mRNA表達升高，而p38信號通路的阻斷劑SB203580，以及JNK信號通路的阻斷劑SP600125，盡管可以誘導ADAMTS-4表達的降低，但是與牽張應力組相比較，差異無統(tǒng)計學意義。蛋白質(zhì)印跡實驗，在蛋白表達水平上進一步驗證了這個結(jié)果，見圖2。

Figure 1 The relative mRNA expression profiling of anabolic genes and catabolic genes under different magnitudes of mechanical stretch圖1 合成代謝基因和分解代謝基因在不同牽張應力下的mRNA水平上的表達情況

Figure 2 Effects of MAPK inhibitor on the mRNA(A)and protein expression(B)profiling of ADAMTS-4圖2 采用MAPK阻斷劑后觀察ADAMTS-4分別在mRNA（A）和蛋白水平（B）的表達（＊P＜0.05）

3 討論

在應力的作用下，椎間盤細胞的代謝將影響椎間盤基質(zhì)的降解與合成，從而導致椎間盤重建。在這一過程中合成代謝基因與分解代謝基因發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，周期性張應變可以引起椎間盤細胞的椎間盤基質(zhì)代謝基因表達的改變，而且不同牽張幅度的應力，導致椎間盤基質(zhì)基因表達不同，在低牽張應力下，合成代謝基因表達升高，分解代謝基因表達降低；在高牽張應力下，分解代謝基因表達升高，合成代謝基因表達降低。這些結(jié)果提示，椎間盤組織在遭受周期性高應力環(huán)境下，可能會引起椎間盤基質(zhì)分解增加，合成減少，從而導致退變的發(fā)生[5]。

ADAMTS-4是一種含有Zn離子的聚集蛋白聚糖水解酶，它帶有血小板凝集酶敏感蛋白樣模體，能夠降解細胞基質(zhì)中多聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原，導致退變的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，在18%的應變下，椎間盤細胞分解代謝基因中ADAMTS-4表達升高。研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-4表達隨應力拉伸幅度升高而表達增強[6]。

MAPKs蛋白激酶家族可以接受細胞外力學信號，將胞外刺激信號傳遞給胞核，調(diào)控細胞增殖、分化、遷移和凋亡等，該家族包括ERK、JNK和p38等亞族[7]。筆者進一步對應力調(diào)節(jié)ADAMTS-4表達的機制進行研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2的阻斷劑U0126，能明顯阻斷應力誘導的ADAMTS-4的表達，而p38和JNK的阻斷劑SP6000125和SB203580阻斷應力誘導ADAMTS-4表達作用不明顯。提示，應力主要通過ERK1/2來調(diào)節(jié)ADAMTS-4的表達，進而影響椎間盤細胞的分解代謝。

本研究表明，不同拉伸幅度的牽張應力對椎間盤纖維化細胞的生物學行為的影響不同，其結(jié)果可以影響椎間盤的退變。在這一過程中，周期性張應力可以通過ERK1/2-ADAMTS-4信號通路調(diào)控了椎間盤細胞的分解代謝。以上結(jié)果進一步豐富了應力對椎間盤細胞影響的研究，對探討應力導致椎間盤退變機制具有重要的參考意義。

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（2013-12-23收稿 2014-01-08修回）

（本文編輯 魏杰）

Effects of Different Magnitudes of Mechanical Stretch on Human Intervertebral Disc Cells

FAN Dongwei,CHEN Zhongqiang△,GUO Zhaoqing,QI Qiang,LI Weishi
Department of Orthopaedics,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

ObjectiveTo investigate the effects of different magnitudes of mechanical stress on human intervertebral disc degeneration.MethodsThe human intervertebral disc cells were subjected to different magnitudes of mechanical stress(0,6%,12%,or 18%elongation)for 24 h using a Flexercell Strain Unit.The mRNA expressions of anabolic genes(collagen-1A1,collagen-2A1,aggrecan and versican)and catabolic genes(MMP-3,MMP-13,ADAMTS-4 and ADAMTS-5)were examined by real-time PCR and Western blot methods.ResultsThe expression levels of collagen-1A1 and collagen-2A1 were increased at 12%of mechanical stress,and collagen-2A1 was decreased at 18%of mechanical stress compared with those of control.The mRNA expressions of catabolic genes,MMP-13 and ADAMTS-5,were increased at 12%and 18%of mechanical stress than those of control.The mechanical stretch induced a magnitude-dependent increase in ADAMTS-4 synthesis,which was finely tuned by stretching-triggered activation of distinct mitogen-activated protein kinase cascades.Specifically,an ERK1/2 specific inhibitor,U0126,significantly inhibited the stretching-induced ADAMTS-4 expression,whereas the inhibitors of p38 and JNK,SP6000125 and SB203580,showed only slightly effect on the stretching-induced ADAMTS-4 expression.ConclusionThe different magnitudes of mechanical stretch exhibited different effects on the biological behavior of intervertebral disc cells,which profoundly affects the intervertebral disc degeneration.

fractures,stress;intervertebral disk;signal transduction;intervertebral disc cells；ADAMTS-4；ERK

R34 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.015

*國家自然科學基金資助項目（項目編號：30801156、81071505）

北京大學第三醫(yī)院骨科（郵編100191）

△通訊作者 E-mail：chenzq@bjmu.edu.cn