不同劑量氯喹對(duì)戊四氮慢性致癇大鼠腦內(nèi)谷氨酸受體2表達(dá)的影響

荊麗麗+譚宏偉+于靜+楊冰+吳淑華+李建民

[摘要] 目的 觀察不同劑量氯喹對(duì)戊四氮（PTZ）慢性致癇大鼠腦內(nèi)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異■唑丙酸受體（AMPA-GluR2）表達(dá)的影響，探討氯喹在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中的作用。 方法 健康雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組（10只，腹腔注射生理鹽水，40 mg/kg）、PTZ致癇組（10只，腹腔注射0.5%PTZ溶液，40 mg/kg）、氯喹不同劑量治療組（1、2、3組，各10只，分別腹腔注射0.5%氯喹溶液20、40、60 mg/kg）。觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，應(yīng)用Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)氯喹對(duì)各組GluR2表達(dá)的影響。 結(jié)果 PTZ致癇組GluR2表達(dá)明顯減少，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；氯喹可增強(qiáng)GluR2的表達(dá)，PTZ致癇組與氯喹治療2、3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 氯喹能夠劑量依賴性地調(diào)節(jié)GluR2表達(dá)，提示氯喹可通過其對(duì)GluR2的調(diào)節(jié)作用達(dá)到抗癲癇效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 氯喹；癲癇；戊四氮；谷氨酸受體2

[中圖分類號(hào)] R36[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-7210（2014）05（c）-0010-04

Effect of different dose of Chloroquine on GluR2 expression in the brain of rats with epilepsy induced by pentylenetetrazole

JING Lili1 TAN Hongwei1 YU Jing1 YANG Bing1 WU Shuhua2 LI Jianmin2

1.Department of Pathology, Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Shandong Province, Yantai 264100, China; 2.Department of Pathology, Binzhou Medical College, Shandong Province, Yantai 264003, China

[Abstract] Objective To observe the effect of different dose of Chloroquine on AMPA-GluR2 expression in the brain of rats with epilepsy induced by pentylenetetrazole, and to explore the role of Chloroquine in epileptogenesis. Methods 50 male adult Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control group (n=10, intraperitoneal injection of saline solution, 40 mg/kg), pentylenetetrazole (PTZ) group (n=10, intraperitoneal injection of 0.5% pentylenetetrazole, 40 mg/kg), Chloroquine intervening groups (group one, two, three, n=10, intraperitoneal injection of 0.5% Chloroquine 20, 40, 60 mg/kg respectively). The behavior of rats was observed. Expression of GluR2 in the brain of rats was examined by Western Blot and immunohistochemistry methods. Results GluR2 level in PTZ group was lower as compared with control group (P < 0.05). Chloroquine could increased the expression of GluR2, there were significant differences between Chloroquine intervening two, three groups and PTZ group (P < 0.05). Conclusion Chloroquine can moderate the expression of GluR2 by dose dependent, which suggests that Chloroquine may be through its adjuste effect on GluR2 to achieve the antiepileptic effect.

[Key words] Chloroquine; Epilepsy; Pentylenetetrazole; GluR2

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡在癲癇的發(fā)生及發(fā)展過程中具有重要的作用。谷氨酸（Glu）廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其主要通過與Glu受體結(jié)合發(fā)揮作用。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異■唑丙酸（AMPA）受體阻滯劑能夠阻滯癲癇動(dòng)物發(fā)作，提示AMPA受體與癲癇發(fā)生有關(guān)。氯喹是一種傳統(tǒng)的治療瘧疾的藥物，可以通過抑制蛋白質(zhì)的合成和DNA的復(fù)制而發(fā)揮作用。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氯喹可以抑制慢性癲癇大鼠腦內(nèi)神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）的表達(dá)[1-5]，從而達(dá)到抑制癲癇的目的。但氯喹能否通過調(diào)節(jié)GluR2的表達(dá)從而抑制癲癇的發(fā)生發(fā)展，尚未有定論。本文意在研究不同劑量氯喹對(duì)戊四氮（PTZ）致癇大鼠腦內(nèi)GluR2的影響，為臨床治療癲癇提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備

成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠50只[山東煙臺(tái)綠葉制藥有限公司，批號(hào)：SCXK（魯）20030008]，體重125~155 g，實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組：對(duì)照組（10只），腹腔注射生理鹽水，40 mg/kg劑量，每天1次；PTZ致癇組（10只）和氯喹治療組（1組、2組、3組，各10只）腹腔注射0.5% PTZ（Sigma，USA）溶液，40 mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥，造成大鼠慢性癲癇模型。造模成功后，氯喹治療1、2、3組均給予腹腔注射0.5%氯喹溶液（Sigma，USA） 20、40、60 mg/kg，每天1次，注射2周。

1.2 行為學(xué)觀察

大鼠連續(xù)腹腔注射0.5% PTZ 7 d后，可觀察到癇樣發(fā)作。發(fā)作行為參考Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)：無反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：節(jié)律性口角和面部抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)：面部肌肉陣攣抽動(dòng)伴點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：前肢陣攣不伴直立；Ⅳ級(jí)：前肢陣攣伴直立；Ⅴ級(jí)：全身陣攣并跌倒。連續(xù)5次Ⅱ級(jí)以上發(fā)作認(rèn)為造模成功。

1.3 Western Blot法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后快速取腦，裂解，離心，測(cè)定蛋白濃度，確定上樣體積，SDS-PAGE電泳分離，根據(jù)Marker確定GluR2和β-actin位置，轉(zhuǎn)膜后雜交，羊抗GluR2，兔抗β-actin，4℃過夜，加入相應(yīng)二抗后曝光。進(jìn)行條帶掃描分析。比較各組GluR2與β-actin灰度值之比。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后開顱取腦，進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟等相關(guān)處理后包埋、切片（厚度3 μm），切片置于60℃烤箱烤片30 min，脫蠟至水。3% H2O2處理。抗原修復(fù)，加入羊抗GluR2（1∶200，Santa Cruz）4℃作用過夜，即用型二抗，作用30 min后顯色。復(fù)染、分化、脫水、透明、封片，各步驟間用PBS洗滌3次，5 min/次。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞漿染成棕色。選用病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，在200倍視野下選擇各組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)，分析平均光密度值（AOD）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

通過觀察，對(duì)照組未見癲癇發(fā)作，PTZ致癇組出現(xiàn)面部肌肉抽動(dòng)伴點(diǎn)頭，前肢陣攣伴或不伴直立，全身陣攣或跌倒等，連續(xù)5次以上出現(xiàn)Ⅱ~Ⅴ級(jí)級(jí)別不等的癲癇發(fā)作，提示造模成功。應(yīng)用氯喹治療后，與PTZ致癇組比較，氯喹治療1、2、3組癲癇發(fā)作程度有所減輕，并且隨著氯喹劑量的增加，效果越明顯。

2.2 Western Blot結(jié)果

結(jié)果表明，與對(duì)照組（0.8178±0.0809）比較，PTZ致癇組GluR2表達(dá)降低（0.5844±0.0633），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；氯喹治療組[1組：（0.6974±0.0540）；2組：（0.7209±0.0674）；3組：（0.7987±0.0783）]GluR2表達(dá)逐漸升高，氯喹治療2、3組GluR2表達(dá)與PTZ致癇組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

N：對(duì)照組；P：PTZ致癇組；C1：氯喹治療1組；C2：氯喹治療2組；C3：氯喹治療3組

圖1 各組GluR2及內(nèi)參β-actin表達(dá)情況

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

GluR2陽(yáng)性細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞，主要分布在皮質(zhì)區(qū)，表達(dá)部位為胞漿。PTZ致癇組GluR2表達(dá)最弱，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；給予氯喹后，隨給藥劑量的增高，GluR2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)；氯喹治療2、3組與PTZ致癇組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），氯喹治療1組與PTZ致癇組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1、圖2。

表1 各組GluR2表達(dá)平均光密度值（x±s）

注：與對(duì)照組比較，aP < 0.05；與PTZ致癇組比較，bP < 0.05；PTZ：戊四氮

3 討論

Glu是一種重要的興奮性氨基酸，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，具有重要作用。學(xué)者研究表明，在癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中存在Glu的大量蓄積，致使再攝取障礙，隨之激活Glu受體，使神經(jīng)元異常放電，導(dǎo)致癲癇的發(fā)生[6-12]。由此，對(duì)于Glu受體的研究成為熱點(diǎn)。Glu受體分為兩類，一類為代謝型受體（mGluRs），一類為離子型受體（iGluRs）。mGluRs主要通過與膜內(nèi)G蛋白偶聯(lián)，mGluRs被激活后，通過G蛋白效應(yīng)酶、第二信使等組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起作用，產(chǎn)生較緩慢的生理反應(yīng)。iGluRs通過離子通道，形成受體通道復(fù)合物，介導(dǎo)信號(hào)傳遞，主要分為N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體和非NMDA受體。非NMDA受體中AMPA受體逐漸受到重視，AMPA家族包括四個(gè)結(jié)構(gòu)極為相似的亞基GluR1~4，各亞基的氨基酸同源性達(dá)到70%，這些亞基對(duì)某些離子有一定的通透性，從而可以介導(dǎo)癲癇的發(fā)生。GluR2是AMPA受體重要的亞基，有人認(rèn)為如果神經(jīng)元的GluR2表達(dá)下調(diào)，則神經(jīng)元更加容易受到損傷，這就是所謂的GluR2假說。

早在1944年氯喹便開始應(yīng)用于臨床，最初用來治療瘧疾，后用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，有一定的效果。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)于氯喹的認(rèn)識(shí)不斷提高，有文獻(xiàn)報(bào)道，近年來氯喹在治療艾滋病方面有質(zhì)的飛躍[13-14]，主要用于防止病毒的復(fù)制，干擾DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成[15]。氯喹具有成本較低、耐藥性好，具有免疫調(diào)節(jié)作用等優(yōu)點(diǎn)，可通過抑制炎癥介質(zhì)（如TNF-α和IL-1）的產(chǎn)生[3]，從而抑制炎性反應(yīng)。本課題組相關(guān)人員前期研究表明，氯喹能夠抑制PTZ誘導(dǎo)的急性大鼠癲癇發(fā)作，對(duì)癲癇大鼠模型海馬和大腦皮質(zhì)的NMDAR1和Glu表達(dá)有抑制作用[2]。同時(shí)，氯喹可抑制體外激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞[16]。目前氯喹已用于多種疾病的治療。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯喹可以抑制PTZ導(dǎo)致的大鼠癲癇發(fā)作，使癲癇大鼠大腦皮質(zhì)GluR2的表達(dá)升高，并且隨著氯喹治療劑量的增加，GluR2的表達(dá)逐漸升高。通過查閱文獻(xiàn)，并結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示氯喹具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。但是氯喹作用機(jī)制復(fù)雜，同時(shí)具有一定的副作用，還有待于進(jìn)行更加深入的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Zhang S，Zhu C，Liu Q，et al. Effects of chloroquine on GFAP，PCNA and CyclinD1 in hippocampus and cerebral cortex of rats with seizures induced by pentylenetetrazole [J]. Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2005，25（5）：625-628.

[2]張樹華，朱長(zhǎng)庚，劉慶瑩，等.氯喹對(duì)戊四氮致癇大鼠皮質(zhì)和海馬谷氨酸和NMDAR1表達(dá)的影響[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2006，15（1）：18-23.

[3]張樹華，朱長(zhǎng)庚，劉慶瑩，等.氯喹對(duì)戊四氮致癇大鼠皮質(zhì)和海馬白細(xì)胞介素1β及腫瘤壞死因子α表達(dá)的影響[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2005，14（5）：491-495.

[4]吳淑華，荊麗麗，朱曉晶，等.不同劑量氯喹對(duì)戊四氮慢性致癇大鼠腦內(nèi)nNOS表達(dá)的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2012，28（4）：392-396.

[5]荊麗麗，吳淑華，楊東霞，等.氯喹對(duì)戊四氮慢性致癇大鼠海馬GluR2及nNOS表達(dá)的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2011，27（4）：428-432.

[6]Campisi A，Gulino M，Acquaviva R，et al. Reactive oxygen species levels and DNA fragmentation onastrocytes in primary culture after acute exposure to low intensity microwave electromagnetic field [J]. Neurosci Lett，2010，473（1）：52-55.

[7]Benarroch EE. Neuron-astrocyte interactions：partnership for normal function and disease in the central nervous system [J]. Mayo Clin Proc，2005，80（10）：1326-1338.

[8]Juge N，Gray JA，Omote H，et al. Metabolic control of vesicular glutamate transport and release [J]. Neuron，2010，68（1）：99-112.

[9]Rossi DJ，Oshima T，Attwell D. Glutamate release in severe brain ischaemia is mainly by reverseduptake [J]. Nature，2000，403（6767）：316-321.

[10]Ramos-Mandujano G，Vazquez-Juarez E，Hernandez-Benitez R，et al. Thrombin potently enhances swelling-sensitive glutamate efflux from cultured astrocytes [J]. Glia，2007， 55（9）：917-925.

[11]Fellin T，Pascual O，Gobbo S，et al. Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of extrasynaptic NMDA receptors [J]. Neuron，2004，43（5）：729-743.

[12]Fiacco TA，McCarthy KD. Intracellular astrocyte calcium waves in situ increase the frequency of spontaneous AMPA receptor currents in CA1 pyramidal neurons [J]. Neuroscience，2004，24（3）：722-732.

[13]Savarino A，Boelaert JR，Cassone A，et al. Effects of chloroquine on viral infection： an old drug against today's diseases [J]. Lancet Infections Diseases，2003，3（11）：722-727.

[14]Vijaykumar TS，Nath A，ChauhanA. Chloroquine mediated molecular turning of astrocytes for enhanced permissiveness to HIV infection [J]. Virology，2008，381（1）：1-5.

[15]Briceno E，Calderon A，Sotelo J. Institutional experience with chloroquine as adjuvant to the therapy for glooblastomamultiforme [J]. Durg Neurol，2007，67（4）：388-391.

[16]荊麗麗，吳淑華.氯喹抑制體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，28（10）：392-396.

（收稿日期：2014-01-24本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 山東省教育廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號(hào)JO8LG14）。

[7]Benarroch EE. Neuron-astrocyte interactions：partnership for normal function and disease in the central nervous system [J]. Mayo Clin Proc，2005，80（10）：1326-1338.

[8]Juge N，Gray JA，Omote H，et al. Metabolic control of vesicular glutamate transport and release [J]. Neuron，2010，68（1）：99-112.

[9]Rossi DJ，Oshima T，Attwell D. Glutamate release in severe brain ischaemia is mainly by reverseduptake [J]. Nature，2000，403（6767）：316-321.

[10]Ramos-Mandujano G，Vazquez-Juarez E，Hernandez-Benitez R，et al. Thrombin potently enhances swelling-sensitive glutamate efflux from cultured astrocytes [J]. Glia，2007， 55（9）：917-925.

[11]Fellin T，Pascual O，Gobbo S，et al. Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of extrasynaptic NMDA receptors [J]. Neuron，2004，43（5）：729-743.

[12]Fiacco TA，McCarthy KD. Intracellular astrocyte calcium waves in situ increase the frequency of spontaneous AMPA receptor currents in CA1 pyramidal neurons [J]. Neuroscience，2004，24（3）：722-732.

[13]Savarino A，Boelaert JR，Cassone A，et al. Effects of chloroquine on viral infection： an old drug against today's diseases [J]. Lancet Infections Diseases，2003，3（11）：722-727.

[14]Vijaykumar TS，Nath A，ChauhanA. Chloroquine mediated molecular turning of astrocytes for enhanced permissiveness to HIV infection [J]. Virology，2008，381（1）：1-5.

[15]Briceno E，Calderon A，Sotelo J. Institutional experience with chloroquine as adjuvant to the therapy for glooblastomamultiforme [J]. Durg Neurol，2007，67（4）：388-391.

[16]荊麗麗，吳淑華.氯喹抑制體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，28（10）：392-396.

（收稿日期：2014-01-24本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 山東省教育廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號(hào)JO8LG14）。

[7]Benarroch EE. Neuron-astrocyte interactions：partnership for normal function and disease in the central nervous system [J]. Mayo Clin Proc，2005，80（10）：1326-1338.

[8]Juge N，Gray JA，Omote H，et al. Metabolic control of vesicular glutamate transport and release [J]. Neuron，2010，68（1）：99-112.

[9]Rossi DJ，Oshima T，Attwell D. Glutamate release in severe brain ischaemia is mainly by reverseduptake [J]. Nature，2000，403（6767）：316-321.

[10]Ramos-Mandujano G，Vazquez-Juarez E，Hernandez-Benitez R，et al. Thrombin potently enhances swelling-sensitive glutamate efflux from cultured astrocytes [J]. Glia，2007， 55（9）：917-925.

[11]Fellin T，Pascual O，Gobbo S，et al. Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of extrasynaptic NMDA receptors [J]. Neuron，2004，43（5）：729-743.

[12]Fiacco TA，McCarthy KD. Intracellular astrocyte calcium waves in situ increase the frequency of spontaneous AMPA receptor currents in CA1 pyramidal neurons [J]. Neuroscience，2004，24（3）：722-732.

[13]Savarino A，Boelaert JR，Cassone A，et al. Effects of chloroquine on viral infection： an old drug against today's diseases [J]. Lancet Infections Diseases，2003，3（11）：722-727.

[14]Vijaykumar TS，Nath A，ChauhanA. Chloroquine mediated molecular turning of astrocytes for enhanced permissiveness to HIV infection [J]. Virology，2008，381（1）：1-5.

[15]Briceno E，Calderon A，Sotelo J. Institutional experience with chloroquine as adjuvant to the therapy for glooblastomamultiforme [J]. Durg Neurol，2007，67（4）：388-391.

[16]荊麗麗，吳淑華.氯喹抑制體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，28（10）：392-396.

（收稿日期：2014-01-24本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 山東省教育廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號(hào)JO8LG14）。