合成紅藻氨酸對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞微絲表達(dá)及縫隙連接的影響

張 潔， 許 華

(1暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632； 2山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西大醫(yī)院藥劑科，山西 太原 030032)

在神經(jīng)組織所有膠質(zhì)細(xì)胞中，星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, AST)數(shù)量最多，分布最廣。AST不僅與神經(jīng)元的功能活動(dòng)及突觸傳遞等多種正常生理活動(dòng)有關(guān)，而且與神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持、神經(jīng)組織的損傷與修復(fù)過(guò)程密切相關(guān)。近年來(lái)，星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇發(fā)病過(guò)程中作用也越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1]。它的異常改變除涉及到細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、代謝活動(dòng)、蛋白合成等方面外，其細(xì)胞間縫隙連接及與縫隙連接密切相關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)變化也與癲癇發(fā)病機(jī)制有關(guān)。 紅藻氨酸(kainic acid, KA) 系紅海藻海人草(Digeneasimplex)的提取物，與興奮性氨基酸谷氨酸(glutamate, Glu)的結(jié)構(gòu)相似，可誘發(fā)癲癇的發(fā)生，目前已被廣泛用作動(dòng)物癲癇模型造模劑，但其昂貴的價(jià)格影響了其在研究中的應(yīng)用。本研究所用的合成紅藻氨酸(synthetic kainic acid, SKA)，為KA的人工合成品。我們前期進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，SKA腹腔注射可誘發(fā)Wistar大鼠癲癇發(fā)作，具有作用穩(wěn)定、階段性明顯及死亡率較低的特點(diǎn)[2]。在此基礎(chǔ)上，本文模擬神經(jīng)元興奮環(huán)境下, 即高濃度KCl 環(huán)境下，研究SKA對(duì)大鼠原代AST骨架微絲蛋白——纖絲狀肌動(dòng)蛋白(filamentous actin, F-actin)變化的影響，并使用細(xì)胞縫隙連接(gap junctions, GJ)通道阻滯劑1-庚醇(1-heptanol, 1-Hep)，探討SKA對(duì)AST細(xì)胞縫隙連接的影響，旨在闡明SKA誘發(fā)大鼠癲癇的作用機(jī)制，以期從新的角度為癲癇的防治提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物 出生后24 h內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠，雌雄不拘，購(gòu)于中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資格認(rèn)可證號(hào)為2006A072。

1.2藥品及試劑 SKA由廣州諾東生物科技有限公司提供，白色針狀晶體，分子式：C10H15NO4·H2O，分子量為231.2；高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果顯示，其純度大于99%。對(duì)照品KA購(gòu)自Sigma，膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體購(gòu)自廣州儀濤科學(xué)儀器有限公司；DMED/F12培養(yǎng)液為Gibco產(chǎn)品；Cy3標(biāo)記的抗兔IgG、DAPI和1-Hep均為Sigma產(chǎn)品；鬼筆環(huán)肽(rhodamine phallacidin R415)為Molecular Probes產(chǎn)品。

1.3主要儀器 LSM510 META激光共聚焦掃描顯微鏡(Carl Zeiss)；DMRA2型正立電動(dòng)熒光顯微鏡(Leica)。

2 方法

2.1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的獲取 參照方法[3]，取新生24 h內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠，無(wú)菌操作下分離出乳鼠大腦，置于含有冷DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剪碎組織，移入離心管中，按1∶1比例加入0.25%胰酶。15 min后終止消化，用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清液，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，輕輕吹打盡量使細(xì)胞分散存在；接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。差速貼壁40 min，去除成纖維細(xì)胞；收集未貼壁的細(xì)胞以4×109/L密度加入到25 cm2培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后換液；此后每3 d換液(15%胎牛血清的DMEM/F12)1次，繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，可有效去除神經(jīng)元、神經(jīng)前體細(xì)胞、血細(xì)胞等。

2.2正常大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化及傳代 上述原代細(xì)胞培養(yǎng)7～10 d，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)90%以上時(shí)，棄廢液、漂洗、加入新鮮完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中2 h；繼之于37 ℃、250 r/min恒溫?fù)u床振蕩15～18 h，以去除少突膠質(zhì)細(xì)胞；棄上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)振蕩后的貼壁細(xì)胞；次日取出，PBS漂洗3次，加入0.125%胰酶及0.04% EDTA，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化2～3 min，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時(shí)加入含胎牛血清的DMEM/F12終止消化，收集細(xì)胞懸液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，去上清液，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12，按1∶3傳代。

2.3星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 GFAP是AST細(xì)胞的主要成分。利用GFAP抗體,采用免疫熒光組化技術(shù)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定[4]。

2.4實(shí)驗(yàn)分組及各組F-actin免疫熒光檢測(cè) 在6孔板內(nèi)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，于培養(yǎng)皿內(nèi)放入載玻片(22 mm×22 mm)，制備細(xì)胞爬片。第7天待細(xì)胞將爬滿整個(gè)玻片時(shí)換液，進(jìn)行藥物干預(yù)處理。將培養(yǎng)皿隨機(jī)分成5大組，每組3皿，分別為正常對(duì)照組(培養(yǎng)基)、高濃度KCl組(KCl濃度為20 mmol/L )、高濃度KCl+SKA組(又分為SKA不同濃度亞組，分別為SKA 5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和250 μmol/L亞組)、高濃度KCl+1-Hep(1 mmol/L)組及高濃度 KCl+1-Hep+SKA組(又分為SKA不同濃度亞組，分別為SKA 5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和250 μmol/L亞組)。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用PBS輕輕沖洗各組已爬滿細(xì)胞的玻片，加入FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(5 mg/L)，室溫孵育1 h，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白F-actin進(jìn)行直接免疫熒光染色[5]。將染色后的玻片置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，每張玻片選擇一個(gè)形態(tài)典型的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行斷層掃描，獲取三維圖像，將圖像存入計(jì)算機(jī)，用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD) 表示，用SPSS 13.0軟件處理。采用方差分析進(jìn)行組間差異比較，兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AST細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

1.1AST細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化 分離的大腦皮質(zhì)細(xì)胞在種植24 h后大多已貼壁，34 d后細(xì)胞數(shù)量增多，胞體明顯增大，部分細(xì)胞突起逐漸伸長(zhǎng)。至7～10 d，細(xì)胞已長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁，倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞分2層：表層細(xì)胞胞體較小，三角形和梭形胞體居多，胞體周圍有不同程度的光暈，突起多而細(xì)長(zhǎng)；底層細(xì)胞形態(tài)相對(duì)較大，形態(tài)不規(guī)則，胞體暗，胞體周圍光暈不明顯，偶見突起。

利用搖床可使其它雜細(xì)胞脫落，經(jīng)振蕩純化后，原代培養(yǎng)物中的表層細(xì)胞基本消失，細(xì)胞形態(tài)以胞體較大的細(xì)胞為主，底層細(xì)胞近于純化。但隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，雜細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，AST細(xì)胞比例下降。因此，通過(guò)此法獲得的AST細(xì)胞的最佳使用時(shí)間是2代以內(nèi)的細(xì)胞。各時(shí)期細(xì)胞生長(zhǎng)情況見圖1A～C。

1.2GFAP免疫組化鑒定結(jié)果 結(jié)果顯示，絕大多數(shù)細(xì)胞為GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，證明培養(yǎng)的細(xì)胞是AST細(xì)胞，鏡下胞體呈紅色、胞核顯藍(lán)色；而GFAP未表達(dá)細(xì)胞即非星形膠質(zhì)細(xì)胞，僅可見其藍(lán)色胞核，見圖1D。

Figure 1. Primary astrocytes cultured for 24 h (A), 72 h (B) and 8 d (C), and identified by GFAP immunofluorescence staining (D).A,C: ×50; B,D: ×50.

2 SKA對(duì)AST細(xì)胞 F-actin表達(dá)的影響

2.1正常AST細(xì)胞F-actin形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu) 鏡下鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的F-actin呈橘紅色，分布在細(xì)胞胞質(zhì)，呈細(xì)束或細(xì)絲狀，沿細(xì)胞極性平行排列，在細(xì)胞邊緣處密集，鏡下可見細(xì)胞邊緣處熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，逐層向內(nèi)漸弱，見圖2A；細(xì)胞突起部位F-actin呈現(xiàn)細(xì)絲狀或曲而不直，整齊排列，似毛刺，各毛刺間距大致相等，見圖2B，與非細(xì)胞突起區(qū)域筆直細(xì)線狀形態(tài)差別較大，鏡下可見其熒光強(qiáng)度較細(xì)胞內(nèi)部的F-actin弱。

Figure 2. Morphology of F-actin in the normal astrocyte (phalloidin direct immunofluorescence staining, ×200).A: F-actin in the normal astrocyte;B: intercellular F-actin filopodia-like protrusions.

2.2SKA對(duì)F-actin形態(tài)學(xué)的影響 KCl作用于AST細(xì)胞24 h后，熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組增強(qiáng)，可見F-actin細(xì)絲狀物比正常對(duì)照組明顯密集，見圖3A。同時(shí)給予KCl和SKA后，F(xiàn)-actin細(xì)絲狀物數(shù)目增多、增粗、密集，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明SKA作用后F-actin表達(dá)增多，見圖3B、C。給予KCl+1-Hep后F-actin表達(dá)明顯降低，表現(xiàn)為細(xì)胞F-actin細(xì)絲狀物稀疏，熒光強(qiáng)度弱于KCl組；而KCl+SKA+1-Hep組F-actin絲狀線極細(xì)并愈加稀疏，有些熒光微弱，鏡下難以辨認(rèn)，見圖3D。值得注意的是，所有1-Hep劑量組均可發(fā)現(xiàn)AST細(xì)胞內(nèi)的F-actin部分呈細(xì)絲狀斷裂，其斷端有長(zhǎng)短不齊的細(xì)絲存在，見圖3E；有些則似被橫斷，斷面齊整,見圖3F。SKA不同劑量分組鏡下直接觀察F-actin形態(tài)排布差異較小。

2.3SKA對(duì)F-actin表達(dá)量的影響 高濃度的KCl作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，F(xiàn)-actin的熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組升高(P<0.01)；而給予KCl+SKA 24 h后F-actin的熒光強(qiáng)度較KCl組明顯升高(P<0.01)，且不同濃度SKA亞組的結(jié)果顯示，隨SKA劑量增加，F(xiàn)-actin熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Figure 3. The effects of different treatments on the morphological changes of F-actin (×100).A: KCl group; B,C: KCl+SKA groups; D～F: KCl+SKA+1-Hep groups.

2.4SKA對(duì)GJ的影響 給予GJ通道阻滯劑1-Hep，可影響細(xì)胞間的聯(lián)系，表現(xiàn)為KCl+1-Hep和KCl+SKA+1-Hep組的熒光強(qiáng)度均明顯降低，KCl+SKA+1-Hep組的熒光強(qiáng)度降低更甚，見表1。我們推測(cè)SKA不僅具有穩(wěn)定F-actin結(jié)構(gòu)并抑制其解聚的作用，還可能促進(jìn)了細(xì)胞間的GJ開放，增加了腦細(xì)胞間興奮性的傳遞，引發(fā)癲癇的發(fā)作。

表1 SKA對(duì)AST細(xì)胞F-actin表達(dá)的影響

討 論

近年來(lái)，星形膠質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞骨架蛋白與癲癇關(guān)系的研究已經(jīng)成為癲癇發(fā)病機(jī)制探討的新熱點(diǎn)。細(xì)胞骨架蛋白分為微管、微絲和中間絲3種類型。微絲是3種骨架蛋白中最細(xì)的1種，在細(xì)胞質(zhì)中成束狀平行排列或疏散成網(wǎng)狀，主要由actin組裝而成。而actin以F-actin和球狀肌動(dòng)蛋白 (G-actin) 形式存在并保持動(dòng)態(tài)平衡[6]，參與細(xì)胞形態(tài)維持及細(xì)胞間緊密連接、細(xì)胞遷移等[7-8]。此外中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的GJ形成縫隙連接網(wǎng)，傳導(dǎo)電活動(dòng)，認(rèn)為與癲癇的形成有關(guān)，而actin形態(tài)的完整性是決定GJ功能的基礎(chǔ)[9-12]。

本研究所用SKA的致癇作用、作用機(jī)理等均同于KA。由于其結(jié)構(gòu)和谷氨酸類似，可作用于脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Glu受體，既可直接興奮神經(jīng)元，又可增強(qiáng)細(xì)胞膜對(duì)鈉離子的通透性而使神經(jīng)細(xì)胞去極化。實(shí)驗(yàn)以高濃度的KCl作用于培養(yǎng)的AST細(xì)胞，模擬神經(jīng)元興奮時(shí)的細(xì)胞外環(huán)境，觀察不同處理對(duì)AST細(xì)胞F-actin變化的影響。結(jié)果顯示：(1) 高濃度KCl培養(yǎng)條件下，AST細(xì)胞F-actin免疫熒光強(qiáng)度比對(duì)照組增強(qiáng)，即F-actin含量增加。經(jīng)GJ通道阻滯劑1-Hep作用后，細(xì)胞F-actin含量減少，提示F-actin含量變化與GJ之間可能存在某種關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)影響了細(xì)胞骨架微絲裝配和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，推測(cè)當(dāng)神經(jīng)元興奮時(shí)，胞外呈高鉀狀態(tài)，細(xì)胞骨架actin發(fā)生重構(gòu)，G-actin向F-actin轉(zhuǎn)化，故F-actin含量增加。(2)高濃度KCl和SKA合用，AST細(xì)胞的F-actin免疫熒光強(qiáng)度較單獨(dú)KCl組明顯升高，提示SKA可能通過(guò)作用于AST細(xì)胞膜上的谷氨酸受體，致使細(xì)胞去極化，這種去極化狀態(tài)引發(fā)細(xì)胞骨架微絲actin的轉(zhuǎn)化或合成，F(xiàn)-actin增多。此結(jié)果和Zeng等[13]發(fā)現(xiàn)KA誘發(fā)小鼠癲癇后海馬和大腦皮質(zhì)F-actin相應(yīng)減少的結(jié)果不相一致。(3) 已證明GJ阻滯劑具有抗癲癇作用[14]。本研究使用GJ通道阻滯劑1-Hep，使得SKA所致的F-actin熒光強(qiáng)度明顯降低，推測(cè)SKA所致F-actin增多可能和GJ有關(guān)，是否SKA誘發(fā)癲癇作用和其引發(fā)GJ開放、促進(jìn)了細(xì)胞間死亡信號(hào)的彌散有關(guān)[15]；另一方面F-actin熒光強(qiáng)度減少，是否是1-Hep降低GJ通透性或關(guān)閉GJ，AST細(xì)胞間通訊能力下降，而微絲的變化又與細(xì)胞間信息傳導(dǎo)有關(guān)，這種信息導(dǎo)致F-actin解聚或向G-actin轉(zhuǎn)化，顯示為F-actin含量減少。

本研究還發(fā)現(xiàn)，KCl+SKA+1-Hep組F-actin形態(tài)的完整性遭到破壞，細(xì)胞微絲有斷裂現(xiàn)象(圖3F)，這恰好可從形態(tài)學(xué)角度解釋GJ確實(shí)出現(xiàn)異常。但F-actin細(xì)絲出現(xiàn)整齊的橫斷面的原因還不清楚，這是否與1-Hep的自身特性有關(guān)，目前還不得而知。結(jié)果可見，加入1-Hep后，SKA組F-actin熒光強(qiáng)度降低，但其F-actin含量并不隨SKA劑量變化而變化，推測(cè)原因可能是所選用1-Hep劑量足以阻斷所用SKA劑量范圍內(nèi)所有GJ通道所致。

KA對(duì)神經(jīng)元的損害作用已有大量實(shí)驗(yàn)研究，一般認(rèn)為在使用1～50 μmol/L濃度時(shí)，KA對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元已產(chǎn)生神經(jīng)興奮毒性作用，增大到100～500 μmol/L時(shí)，開始具有細(xì)胞毒性作用，存在劑量依賴性關(guān)系[16]。但KA對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SKA的濃度在5～250 μmol/L的范圍均可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的F-actin表達(dá)增加，但量效關(guān)系不甚明顯，其原因有待進(jìn)一步研究。此外，GJ在癲癇的發(fā)生和持續(xù)中的作用及SAK對(duì)GJ的具體影響，值得進(jìn)一步研究。

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