MicroRNA-3666調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞PTEN基因的表達(dá)*

倪 芳， 張玉俠， 汪心怡， 趙 華， 汪思應(yīng)

(安徽醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

MicroRNA(miRNA,miR)是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA, 可以在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1]。研究發(fā)現(xiàn), miRNA不僅在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程中發(fā)揮重要作用[2], 越來越多的研究表明, miRNA在包括惡性血液病在內(nèi)的多種疾病發(fā)病中同樣發(fā)揮著重要作用[3-4]。盡管目前miRNA在白血病中的研究取得了一些進(jìn)展，但仍有大量miRNA的功能是未知的。本研究中的miR-3666，其在白血病細(xì)胞中的表達(dá)及其相關(guān)功能至今尚未見報(bào)道，我們利用TargetScan軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，miR-3666 與抑癌基因第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)的mRNA 3’端非翻譯區(qū)域(3’-untranslated region，3’UTR)存在3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-3666 對(duì)PTEN的表達(dá)可能具有調(diào)控作用。本研究旨在進(jìn)一步檢測(cè)miR-3666在白血病細(xì)胞中的表達(dá)，并驗(yàn)證miR-3666對(duì)PTEN的靶向調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 試劑

DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和熱滅活的胎牛血清購(gòu)自Gibco；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自 Invitrogen；Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V 購(gòu)自Amaxa Biosystems；氯仿、乙醇和異丙醇 (分析純)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DEPC(分析純)購(gòu)自上海生工有限公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen；micro-RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScript Reverse Transcription Kit)、hsa-miR-3666 及內(nèi)參照RNU6B引物和microRNA定量PCR檢測(cè)試劑盒(miScript SYBR Green PCR Kit)均購(gòu)自Qiagen；雙螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psi-CHECK-2和雙螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購(gòu)自Promega；PTEN鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz； HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠II抗購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

2 細(xì)胞系和原代細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎細(xì)胞株HEK293T采用DMEM 培養(yǎng)基和10%胎牛血清培養(yǎng)；慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。2種細(xì)胞系均由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。人原代白血病細(xì)胞分離自臨床初診未治的白血病病人外周血。

3 方法

3.1miRNA的提取及qRT-PCR Trizol提取細(xì)胞總RNA(含miRNA)，細(xì)胞的cDNA合成采用miScript Reverse Transcription Kit(含通用反向引物)(Qiagen)；正向引物購(gòu)自Qiagen公司miScript Primer Assays。 按照miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen)說明書配制PCR反應(yīng)液，混勻后置于Rotor Gene 3000實(shí)時(shí)定量PCR儀，進(jìn)行miRNA的定量PCR測(cè)定，按下列條件擴(kuò)增: 95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)分析計(jì)算出模板的拷貝數(shù)，并進(jìn)行相對(duì)定量分析。

3.2miRNA 模擬體及抑制體的合成 hsa-miR-3666(miRBase accession No.MI0016067)的模擬體(mi-mic)及陰性對(duì)照(negative control， NC)、FAM標(biāo)記的miR-3666抑制體(inhibitor， FAM-anti-miR-3666) 及陰性對(duì)照(inhibitor NC，F(xiàn)AM-anti-miR-C)均由上海吉瑪生物公司設(shè)計(jì)合成。

3.3雙螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 GenBank中查找miR-3666靶基因PTEN3′UTR序列，由上海生工合成PTEN-WT 3’UTR(包含了整段預(yù)測(cè)miR-3666結(jié)合序列的上、下游各100 bp左右的片段)和PTEN-mutant 3’UTR(相比PTEN-WT 3’UTR缺失了整段預(yù)測(cè)的miR-3666結(jié)合序列)基因，且兩端具有XhoI 和NotI酶切位點(diǎn)；之后重組入雙螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2多克隆位點(diǎn)，分別獲得野生型及突變型克隆并測(cè)序鑒定正確性。

3.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和雙螢光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 將HEK293T細(xì)胞接種到96孔板中，每孔5×103細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后用無抗生素的DEME-洗滌2次，按照Lipofectamine 2000說明書配制轉(zhuǎn)染試劑，將0.2 μg雙螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒及20 nmol/L終濃度的miRNA mimic或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，6 h后更換DMEM完全培養(yǎng)基，48 h后用Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)檢測(cè)螢光素酶的活性。

3.5核轉(zhuǎn)染(nucleofection)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V 試劑盒說明書，用核轉(zhuǎn)染儀Nucleofector II (Amaxa Biosystems) 分別將FAM-anti-miR-3666 及陰性對(duì)照anti-miR-C轉(zhuǎn)入K562 白血病細(xì)胞系，方法如下:血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率后將1×106細(xì)胞用1.5 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基接種于12 孔培養(yǎng)板， 37 ℃、5%CO2孵箱中預(yù)熱。細(xì)胞移至1.5 mL Eppendorf管中，室溫下200×g離心10 min，棄上清，細(xì)胞用100 μL預(yù)熱到室溫的Nueleofector Solution V混懸，并加入200 pmol/L (10 μL) FAM-anti-miR-3666或FAM-anti-miR-C，轉(zhuǎn)移到Amaxa 核轉(zhuǎn)染杯的底部，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。將核轉(zhuǎn)染儀的程序設(shè)置為T-16，并將核轉(zhuǎn)染杯放入杯孔中，按“X”鍵開始程序。結(jié)束后立即拿出轉(zhuǎn)染杯，并用Amaxa 標(biāo)準(zhǔn)吸管將細(xì)移至含有0.5 mL完全培養(yǎng)基的12 孔板中。20 h 后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FAM-anti-miR-3666 轉(zhuǎn)染K562 的效率，并收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.6Western blotting檢測(cè)靶蛋白表達(dá)水平 收集上述不同轉(zhuǎn)染組的K562 細(xì)胞，加入蛋白裂解液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg 樣品蛋白質(zhì)加入等體積上樣緩沖液，經(jīng)SDS-PAGE后，用水浴式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。室溫封閉1 h，加入1∶500 稀釋的小鼠抗人PTEN單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST振搖漂洗10 min×3次，然后加入HRP標(biāo)記的II抗，室溫孵育1 h，取出，TBST振搖漂洗10 min×4次，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)后分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 均數(shù)間的比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-3666 在白血病細(xì)胞中高表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果表明，與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞相比，白血病細(xì)胞系中miR-3666的表達(dá)明顯升高，尤其以K562細(xì)胞系中表達(dá)升高最為顯著,見圖1A；在臨床初診未治的人原代白血病細(xì)胞中，以慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myelognous leukemia, CML)細(xì)胞miR-3666表達(dá)升高最為顯著，見圖1B。

Figure 1. qRT-PCR analysis of miR-3666 expression in various leukemic cell lines (A) and human primary leukemic cells (B) compared to normal PBMC. Mean±SD. AML:n=6; ALL:n=8;CML:n=9.*P<0.05,**P<0.01 vs PBMC or normal.

2 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-3666靶向PTEN基因3’UTR 序列

為了更好地研究miR-3666的生物學(xué)功能，我們通過TargetScan在線分析軟件(www.targetscan.org)，將microRNA名稱hsa-miR-3666輸入檢索框中，點(diǎn)擊“Submit”，系統(tǒng)預(yù)測(cè)出hsa-miR-3666可能的靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靶點(diǎn)非常廣泛，其中抑癌基因PTEN引起了我們的關(guān)注，PTEN3’UTR 含有3個(gè)miR-3666的結(jié)合位點(diǎn),見圖2。

Figure 2. Predicted interaction between miR-3666 and the three putative binding sites in the PTEN 3’UTR.

3 miR-3666對(duì)PTEN基因3’UTR的調(diào)控

為了進(jìn)一步證明miR-3666對(duì)PTEN基因的3’UTR具有直接調(diào)控作用，我們采用雙螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2，構(gòu)建了包含靶基因 WT 3’UTR的野生型克隆(分別包含軟件預(yù)測(cè)的整段miR-3666結(jié)合序列)及包含靶基因 mutant 3’UTR(分別缺失了整段預(yù)測(cè)的miR-3666結(jié)合位點(diǎn))的突變型克隆，并通過測(cè)序鑒定正確。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果初步表明PTEN是miR-3666的潛在靶基因,見圖3A。此外我們發(fā)現(xiàn)：miR-3666能通過野生型PTEN3’UTR(binding site 1)抑制報(bào)告基因的活性，而且這種抑制作用是“miR-3666結(jié)合元件”依賴性的，在人為缺失突變?cè)撛r(shí)(缺失了整段預(yù)測(cè)的miR-3666結(jié)合位點(diǎn)1)，miR-3666即不能對(duì)報(bào)告基因的活性產(chǎn)生抑制效應(yīng),見圖3B。以上結(jié)果表明PTEN是miR-3666的潛在靶基因之一。

Figure 3. Luciferase activity of various reporters in the presence or absence of miR-3666 mimic in HEK293T cells.A: dual-luciferase assay of HEK293T cells transfected with luciferase constructs containing the three putative miR-3666-binding sites (binding site 1, binding site 2 or binding site 3), synthetic mature miR-3666 (miR-3666) or synthetic control miRNA with a scrambled sequence (miR-C); B: dual-luciferase assay of HEK293T cells transfected with luciferase constructs containing wild-type 3’ UTR (WT 3’ UTR) or mutated 3’ UTR (mutant 3’UTR) (with deletion of the miR-3666-responsive element) from PTEN, plus miRNA (as in A).Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs miR-C; ##P<0.01 vs miR-3666 in WT 3’UTR.

4 miR-3666調(diào)控K562白血病細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染FAM-anti-miR-3666 組，PTEN蛋白水平明顯上調(diào),見圖4。這表明PTEN的表達(dá)受miR-3666的調(diào)控。

討 論

白血病的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)很多功能基因(尤其是癌基因、抑癌基因或轉(zhuǎn)錄因子)的時(shí)空、量的表達(dá)差異或突變不僅參與白血病等腫瘤發(fā)病，還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，如p53、PTEN及Her2等基因表達(dá)異?；蛲蛔兣c多種腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[5-7]。PTEN是1997年發(fā)現(xiàn)的編碼具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因，具有雙重腫瘤抑制功能。大量的研究顯示，在多種實(shí)體瘤中存在PTEN基因的突變或低表達(dá)，從而影響其腫瘤抑制功能。近年來PTEN在白血病發(fā)病中的作用逐漸受到重視，PTEN蛋白可以通過其磷酸酶活性抑制多種信號(hào)通路，參與白血病的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究表明，PTEN基因在白血病中突變罕見，但存在不同程度的缺失和低表達(dá)，然而，PTEN基因的表達(dá)調(diào)控的機(jī)制還很不清楚[7]。

近年來發(fā)現(xiàn)的miRNA參與多種功能基因的表達(dá)調(diào)控，它可通過識(shí)別靶基因mRNA 的 3’UTR，并與之結(jié)合，抑制翻譯或?qū)е耺RNA 降解，從而抑制靶基因的表達(dá)[8-9]。目前,已有研究表明某些表達(dá)失調(diào)的miRNA與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也有與急性髓細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病和霍奇金淋巴瘤的細(xì)胞遺傳學(xué)以及臨床治療結(jié)果有關(guān)的miRNA表達(dá)標(biāo)簽的報(bào)道[10-14]。

本研究報(bào)道的miR-3666，我們首次發(fā)現(xiàn)其在人白血病細(xì)胞中顯著高表達(dá)，并進(jìn)一步通過雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了PTEN是miR-3666的潛在靶基因，并且證明在白血病細(xì)胞中下調(diào)miR-3666后，可以促進(jìn)PTEN蛋白的表達(dá)，表明在白血病細(xì)胞中，可能由于miR-3666的高表達(dá)，抑制了抑癌基因PTEN的表達(dá)，從而促進(jìn)白血病的發(fā)生和發(fā)展。因此，miR-3666上調(diào)可能是白血病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一, 也為白血病的治療提供了新的思路。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Bartel DP. MicroRNAs:genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[2] Cheng AM, Byrom MW, Shelton J, et al. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis [J]. Nucleic Acids Res, 2005, 33(4):1290-1297.

[3] Zhou XX, Wang X. Role of microRNAs in chronic lymphocytic leukemia [J]. Mol Med Rep, 2013,8(3):719-725.

[4] So AY, Zhao JL, Baltimore D.The Yin and Yang of microRNAs: leukemia and immunity [J]. Immunol Rev, 2013, 253(1):129-145.

[5] Sanefuji K, Taketomi A, Iguchi T, et al.Significance of DNA polymerase delta catalytic subunit p125 induced by mutant p53 in the invasive potential of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncology, 2010, 79(3-4):229-237.

[6] Scaltriti M, Eichhorn PJ, Cortés J, et al .Cyclin E amplification/overexpression is a mechanism of trastuzumab resistance in HER2+breast cancer patients[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(9):3761-3766.

[7] Wrighton KH.Cancer biology: role of nuclear PTEN revealed [J].Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12(3):134.

[8] Ambros V． The functions of animal microRNAs[J]． Nature，2004，431(7006): 350-355．

[9] Carthew RW，Sontheimer EJ． Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J].Cell,2009,136(4): 642-655．

[10] Calin GA, Ferracin M, Cimmino A,et al. A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia [J]. N Engl J Med, 2005, 353(17):1793-1801.

[11] Garzon R, Volinia S, Liu CG, et al. MicroRNA signatures associated with cytogenetics and prognosis in acute myeloid leukemia [J]. Blood, 2008, 111(6): 3183-3189.

[12] Garzon R, Garofalo M, Martelli MP, et al. Distinctive microRNA signature of acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic mutated nucleophosmin [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(10): 3945-3950.

[13] Navarro A, Gaya A, Martinez A, et al. MicroRNA expression profiling in classical Hodgkin lymphoma[J]. Blood, 2008, 111(5): 2825-2832.

[14] Zhu DX, Miao KR, Fang C, et al. Aberrant microRNA expression in Chinese patients with chronic lymphocytic leukemia [J]. Leuk Res, 2011, 35(6):730-734.