兔頸總動(dòng)脈破裂粥樣硬化斑塊模型炎癥因子的表達(dá)

劉新葉+楊東偉++程勇+劉敏+池豪

[摘要] 目的 探索兔頸總動(dòng)脈破裂粥樣硬化斑塊模型血清炎癥因子的水平。 方法 將30只健康雄性新西蘭白兔隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（n=10）、高脂飲食組（n=10）和球囊損傷組（n=10）。飼養(yǎng)8周后，采用“腔外負(fù)壓”法誘導(dǎo)斑塊破裂，觀察兔血清脂蛋白、白介素-6及hs-CRP水平的變化，彩色多普勒超聲鑒定斑塊形成。 結(jié)果 高脂飼養(yǎng)8周后，球囊損傷組、高脂飲食組的血清脂蛋白水平、頸總動(dòng)脈血流速度、IMT顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而頸總動(dòng)脈內(nèi)徑低于對(duì)照組；血清IL-6、hs-CRP水平顯著高于對(duì)照組，高脂飲食組與球囊損傷組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成，在粥樣硬化斑塊破裂中扮演重要角色；為破裂斑塊的形成提供了一定的動(dòng)物模型理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 兔；動(dòng)物模型；頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；炎癥因子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R743[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-4721（2014）05（b）-0004-04

The express of inflammatory factor in animal model of carotid atherosclerosis plaque rupture

LIU Xin-ye YANG Dong-wei▲ CHENG Yong LIU Min CHI Hao

Department of Cardiology,Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou 450007,China

[Abstract] Objective To explore the express of inflammatory factor in animal model of carotid atherosclerosis plaque rupture. Methods 30 healthy New Zealand white male rabbits were randomly divided into 3 groups including control group (n=10),carotid lesion group with balloon dilation (n=10) and the high fat-diet group (n=10).The concentrations of serum lipoprotein,interleukin-6,hypersensitive C reactive protein,internal diameter of carotids,intima-media thickness and blood flow rate of carotids were obtained used by color Doppler ultrasound respectively,plaque ruptures were triggered by negative pressures of intra-cavity in carotids injury group,the relationship among inflammatory factor,the severity of atherosclerosis and the achievement ratio of carotid atherosclerosis plaque rupture were evaluated. Results 8 weeks after the high-fat feeding,the concentrations of plasma lipoprotein,inflammatory factor,intima-media of carotids and blood flow rate of carotids were significant increase in high fatty combining with carotids injury group and diet group received alone compared with control group (P<0.05).Intima-media of carotids was not smooth and internal diameter was decreased than control group,there had significant difference between high fatty combining with carotids injury group and diet group received alone in inflammatory factor and internal diameter. Conclusion This study has shown inflammatory reaction not only conduce to the progression of atherosclerosis,but also play a important role in atherosclerosis plaque rupture,this study also provide more rationale of animal model in atherosclerosis plaque rupture.

[Key words] Rabbit;Animal model;Carotid atherosclerosis plaque;Inflammatory factor

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病，常累及大中動(dòng)脈，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂與急性血栓形成可導(dǎo)致急性心肌梗死、猝死等[1]。越來(lái)越多的研究[2-3]顯示，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是多種因素參與的慢性炎癥過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要的作用。既往可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型與炎癥因子相關(guān)性的研究，而關(guān)于破裂粥樣硬化斑塊模型與炎癥因子水平的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用一種新的“腔外負(fù)壓吸引”法誘發(fā)兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂，采用彩色多普勒超聲進(jìn)一步驗(yàn)證，觀察實(shí)驗(yàn)前后血清脂蛋白水平以及炎癥因子的變化，為進(jìn)一步深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制提供可靠的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性新西蘭大白兔30只，體重2.0～2.5 kg，購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（n=10）、高脂飲食組（n=10）、球囊損傷組（n=10），均喂養(yǎng)8周。正常對(duì)照組飲食為普通顆?；A(chǔ)飼料，高脂飲食為基礎(chǔ)飼料+4%膽固醇+4%豬油，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 儀器與方法

1.2.1 血清脂蛋白水平的測(cè)定分別于手術(shù)前1 d和動(dòng)物處死前1 d空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取耳緣靜脈血約5 ml，離心分離血清，應(yīng)用日本Olympus AU640全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定白細(xì)胞介素-6（IL-6）的水平，ELISA檢測(cè)高敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP）的濃度，嚴(yán)格按照試劑盒和酶標(biāo)儀說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，至少測(cè)定3次，取平均值。

1.2.2 彩色多普勒超聲檢查應(yīng)用美國(guó)惠普SONOS 5500彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為7.0～11.0 MHz。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象分別于手術(shù)前1 d和動(dòng)物處死前1 d空腹?fàn)顟B(tài)下行彩色多普勒超聲檢查，測(cè)量兔左側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)徑、頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度（intima-media thickness，IMT）及血流速度。將新西蘭大白兔放置于檢查臺(tái)，頭偏向檢查對(duì)側(cè)，充分暴露頸部，在胸鎖乳突肌前或后緣作橫切檢查，超聲探頭沿動(dòng)脈走行向頭側(cè)輕輕移動(dòng)，跨過(guò)頸動(dòng)脈分叉處，仔細(xì)觀察血管內(nèi)膜情況及有無(wú)斑塊和鈣化，所有操作由同一位超聲科高年資醫(yī)師完成。

1.2.3 動(dòng)物模型的構(gòu)建頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)：所有兔術(shù)前普通飲料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，術(shù)前禁食水6 h，腹腔注射氯胺酮（35 mg/kg），固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒，靜脈給予肝素鈉約80 U/kg體重，沿頸部正中切開(kāi)皮膚約5.0 cm，暴露并游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，分離左側(cè)頸內(nèi)、外動(dòng)脈，臨時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，距左頸總動(dòng)脈分叉處約0.5 cm處剪開(kāi)一個(gè)斜形切口，逆行插入直徑約2.5 mm×10.0 mm球囊，連接壓力泵，膨至3個(gè)大氣壓，由近心端緩慢回拉并旋轉(zhuǎn)球囊，反復(fù)3次后撤出導(dǎo)管，結(jié)扎頸外動(dòng)脈起始部，恢復(fù)頸總及頸內(nèi)動(dòng)脈血流，縫合皮膚（圖1）。所有動(dòng)物放置于同一動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2.4 頸動(dòng)脈斑塊破裂激發(fā)飼養(yǎng)8周后采用血栓抽吸裝置對(duì)頸動(dòng)脈斑塊處進(jìn)行腔外負(fù)壓吸引，負(fù)壓容量至于30 ml處、持續(xù)時(shí)間10 s負(fù)壓吸引，激發(fā)斑塊破裂，所有操作由同一實(shí)驗(yàn)人員完成（圖2）。

圖2 術(shù)中所用負(fù)壓吸引裝置

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA法，組間獨(dú)立樣本的比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組超聲檢測(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)徑、IMT、血流速度及激發(fā)斑塊破裂數(shù)量的比較

飼養(yǎng)8周后，高脂飲食組、球囊損傷組較對(duì)照組頸動(dòng)脈內(nèi)徑明顯減少，IMT明顯增加，血流速度明顯增快；球囊損傷組與高脂飲食組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組無(wú)一例激發(fā)斑塊破裂，高脂飲食組有1例激發(fā)斑塊破裂，球囊損傷組有1例球囊損傷后死亡，有8例激發(fā)斑塊破裂（表1）。

表1 各組超聲檢測(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)徑、IMT、血流速度及激發(fā)斑塊破裂數(shù)量的比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高脂飲食組比較，#P<0.05

2.2 血清脂蛋白水平、IL-6及hs-CRP的變化

飼養(yǎng)8周后，高脂飲食組、球囊損傷組血清脂蛋白水平以及炎癥因子水平明顯高于對(duì)照組；球囊損傷組炎癥標(biāo)志物顯著高于高脂飲食組，與激發(fā)斑塊破裂的成功率顯著相關(guān)（表2）。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化作為一種全身性疾病，主要累及體循環(huán)的大、中型動(dòng)脈。目前認(rèn)為，在血管內(nèi)皮功能受損時(shí)，血脂成分進(jìn)入血管內(nèi)膜，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，引起脂質(zhì)斑塊的形成，膠原纖維、彈力纖維和平滑肌細(xì)胞增生，導(dǎo)致血管狹窄以及阻塞性病變。頸動(dòng)脈粥樣硬化與冠心病有著相似的病理生理基礎(chǔ)[4]。頸動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈在解剖結(jié)構(gòu)上具有相同的特點(diǎn)及共同的生理基礎(chǔ)和危險(xiǎn)因素[5-6]。自Pignoli等[5]首次報(bào)導(dǎo)測(cè)量動(dòng)脈IMT以來(lái)，IMT成為動(dòng)脈粥樣硬化研究中一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，有研究表明，在無(wú)心血管疾病患者中頸動(dòng)脈IMT與心肌梗死和猝中風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[7]，頸動(dòng)脈IMT每增加0.1 mm，急性心肌梗死的危險(xiǎn)性增加11%。炎癥是誘發(fā)斑塊破裂的主要原因之一，在不穩(wěn)定斑塊發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中。很多炎癥因子參與其中，例如CRP、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、IL-6、細(xì)胞黏附分子等，這一過(guò)程為心血管疾病，特別是急性冠狀動(dòng)脈綜合征早期的篩選、診斷、分類(lèi)和預(yù)后提供了指導(dǎo)信息[8]。IL-6可由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）等分泌，并可作用于血管壁引起血管壁損傷，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC增生，參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，IL-6還可誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生急性期反應(yīng)蛋白如CRP，促進(jìn)血栓的形成；同時(shí)IL-6還可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和心肌細(xì)胞的黏附作用，促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，從而加重心肌細(xì)胞的損傷。hs-CRP是近年來(lái)報(bào)道的反映斑塊炎癥的生物標(biāo)志物[9]，可以作為急性冠狀動(dòng)脈綜合征的獨(dú)立危險(xiǎn)因素來(lái)檢測(cè)[10-11]，是非S-T段抬高性急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者極早期血運(yùn)重建術(shù)后近期及遠(yuǎn)期死亡的重要獨(dú)立預(yù)報(bào)因子[12-13]。有研究證實(shí)[14]，在不穩(wěn)定型心絞痛（UA）患者中，其敏感度較肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白（cTns）更高，對(duì)UA的早期治療很有幫助。CRP有兩種主要結(jié)合基團(tuán)，能沉淀可溶性配體和顆粒性配體，一旦形成復(fù)合物則立即成為C1q開(kāi)始的經(jīng)典補(bǔ)體途徑的強(qiáng)效激活物，釋放炎癥介質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞間黏附和吞噬細(xì)胞反應(yīng)，溶解靶細(xì)胞；CRP也可作用于單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面受體，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞活化和增生。既往研究表明，內(nèi)皮損傷、基因轉(zhuǎn)染、精神應(yīng)激以及藥物激發(fā)等方法可激發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂，建立破裂粥樣硬化斑塊動(dòng)物模型[15-16]，并觀察到腫瘤壞死因子（TNF-α）、hs-CRP、白介素等炎癥因子升高，但以上激發(fā)方法會(huì)引起全身性炎癥反應(yīng)，影響對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物真實(shí)狀況的研究。本實(shí)驗(yàn)采用“腔外負(fù)壓吸引”誘發(fā)斑塊破裂，首先避免全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生，也不造成內(nèi)皮的直接損傷，可避免以上因素對(duì)炎癥因子的影響。本研究結(jié)果顯示，單純高脂飲食組及球囊損傷組的IL-6及hs-CRP水平均較對(duì)照組顯著升高，表明炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程；而斑塊破裂組與單純高脂飲食組炎癥因子水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示高炎癥反應(yīng)更易導(dǎo)致斑塊破裂，與既往研究結(jié)果一致[17]。

綜上所述，炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成，在粥樣硬化斑塊破裂中扮演重要角色；為破裂斑塊的形成提供了更接近真實(shí)病理狀態(tài)的動(dòng)物模型理論基礎(chǔ)。

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