脯氨酸羥化酶（PHD）在大鼠腎臟中的表達(dá)及PHD抑制劑對5/6腎切除大鼠的作用

俞小芳 蔡潔茹 崔 萌 劉少鵬 方 藝 鄒建洲 丁小強(qiáng)

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科 上海 200032）

脯氨酸羥化酶（PHD）在大鼠腎臟中的表達(dá)及PHD抑制劑對5/6腎切除大鼠的作用

俞小芳 蔡潔茹 崔 萌 劉少鵬 方 藝 鄒建洲 丁小強(qiáng)△

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科 上海 200032）

目的觀察脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain enzyme，PHD）在腎臟內(nèi)的生理性表達(dá)及在慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）進(jìn)程中的動態(tài)表達(dá)變化，探討不同時機(jī)PHD抑制劑治療對CKD的作用。方法雄性SD大鼠行5/6腎切除后（以下簡稱RK大鼠），分別于術(shù)前及術(shù)后第1、2、4、6、8和12周處死大鼠。不同時機(jī)給予RK大鼠PHD抑制劑L-mimosine（L-Mim）治療：早期治療組，治療時間為術(shù)后第2周至第12周；進(jìn)展期治療組，治療時間為術(shù)后第4周至第12周；晚期治療組，治療時間為術(shù)后第8周至第12周。結(jié)果生理情況下PHD2和PHD3在腎臟內(nèi)均有一定程度的表達(dá)。PHD2和PHD3在腎切除術(shù)后表達(dá)逐漸增加，至術(shù)后第6周PHD2達(dá)到峰值，此后表達(dá)明顯減少，至12周時降為基線水平；至第4周PHD3達(dá)到峰值，此后維持較高水平。與對照組相比，早期治療組的腎功能障礙加重；進(jìn)展期治療組的腎功能障礙有所改善；晚期治療組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比，早期治療組低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），而進(jìn)展期和晚期治療組與對照組HIF-1α蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相反，早期治療組HIF-2α蛋白表達(dá)高于對照組（P＜0.05），進(jìn)展期治療組HIF-2α蛋白表達(dá)則明顯高于對照組（P＜0.01），而晚期治療組HIF-2α蛋白表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論P(yáng)HD2和PHD3在RK進(jìn)展過程中呈差異性表達(dá)；在RK病程進(jìn)展的不同階段給予PHD抑制劑L-Mim治療可以對大鼠腎功能產(chǎn)生有利或有害作用，這可能與PHD抑制劑選擇性地活化HIF-α亞型有關(guān)。

脯氨酸羥化酶（PHD）； 低氧誘導(dǎo)因子α（HIF-α）； 腎切除； SD大鼠

脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain enzyme，PHD）是在蛋白水平調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子α（hypoxia-inducible factor-α，HIF-α）表達(dá)的關(guān)鍵酶，它通過催化HIF-α氧依賴性降解區(qū)域中的2個脯氨酸殘基的羥基化實(shí)現(xiàn)對HIF-α蛋白表達(dá)的調(diào)控[1-2]。HIF是調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的重要核轉(zhuǎn)錄因子，HIF-α高表達(dá)對包括急性腎損傷和慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）在內(nèi)的多種臟器的缺血缺氧性疾病可能有較好的治療作用。PHD抑制劑是實(shí)現(xiàn)HIF高表達(dá)的有效藥物。雖然動物研究證實(shí)PHD抑制劑對急性腎損傷有治療作用，但其對CKD的治療作用仍存在爭議[3-8]。本研究以5/6腎切除大鼠（以下簡稱RK大鼠）作為CKD動物模型，選用PHD抑制劑L-mimosine（LMim）作為活化HIF-α的藥物，動態(tài)觀察PHD在RK大鼠病程中的表達(dá)變化及在病程不同階段進(jìn)行的PHD抑制劑治療，明確PHD抑制劑治療對CKD進(jìn)展的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料清潔級SD雄性大鼠，體重180～200 g，購于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。兔抗大鼠PHD2和PHD3多克隆抗體（美國Novus公司），兔抗大鼠HIF-1α和HIF-2α多克隆抗體（美國Abcam公司），大鼠微量白蛋白ELISA試劑盒（美國Kamiya公司），核蛋白抽提試劑盒（美國Active Motif公司），引物合成（上海生工），Trizol試劑（美國TEL-TESTInt公司），ECL顯色系統(tǒng)（美國Pierce公司）。

實(shí)驗(yàn)動物模型制作4%戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg，ip）和消毒后，無菌條件下切除左腎上、下極各1/3腎組織，1周后麻醉下摘除右腎，2次手術(shù)共摘除5/6個腎臟。選取2次手術(shù)后存活的大鼠進(jìn)行以下研究。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組研究分兩階段進(jìn)行。階段1：明確PHD2和PHD3在健康大鼠腎臟內(nèi)的生理性表達(dá)和在RK大鼠腎臟內(nèi)的病理性表達(dá)。處死假手術(shù)的大鼠3只（sham）；其余大鼠行5/6腎切除后隨機(jī)分為6組（n=6），分別于第1、2、4、6、8和12周末處死，留取血、尿和腎組織標(biāo)本。階段2：在RK大鼠病程的不同階段采用L-Mim（美國Calbiochem公司）活化HIF，明確PHD抑制劑治療對CKD的作用。不同階段的確立基于我們以往關(guān)于HIF-1α和HIF-2α在RK大鼠病程中的動態(tài)表達(dá)的研究[9]。RK大鼠隨機(jī)分為4組（n=5）：未治療的對照組（RK）；早期 L-Mim 治療組（RK+LM2-12），L-Mim治療時間為腎切除術(shù)后第2至12周；（3）進(jìn)展期LMim治療組（RK+LM4-12），L-Mim治療時間為腎切除術(shù)后第4至12周；（4）晚期L-Mim治療組（RK+LM8-12），L-Mim治療時間為腎切除術(shù)后第8至12周。在療程結(jié)束的第12周末處死大鼠。L-Mim治療方案：50 mg/kg隔日腹腔注射。

生化指標(biāo)測定收集各組大鼠處死前24 h的尿液，ELISA法測定24 h尿微量白蛋白（24 h Ualb）。處死時心臟穿刺采血，分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清肌酐（serum oreatinine，Scr）濃度和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度。

腎臟病理檢查取部分腎組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度2μm，分別行PAS染色和免疫組化染色，觀察腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化和腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤情況。

免疫組化染色采用Envision二步法檢測PHD2和PHD3的表達(dá)，細(xì)胞深棕色染色為陽性。半定量評分標(biāo)準(zhǔn)：200倍光鏡下，每張切片在腎皮質(zhì)部位隨機(jī)選取20個不重疊的視野，分析各視野下陽性面積百分比，計(jì)0～5分[3]。

Western hlot檢測蛋白質(zhì)抽提殘腎皮質(zhì)核蛋白待測HIF-1α和HIF-2α，抽提殘腎皮質(zhì)總蛋白待測PHD2和PHD3，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每泳道上樣50μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，加Ⅰ抗雜交，4℃冰箱過夜，洗膜，再加相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描。

RT-PCR檢測RNA取殘腎皮質(zhì)100mg，按說明書用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR。PHD2 引物：上游 5＇-CTGGGACGCCAAGGTGA-3＇，下 游 5＇-CAATGTCAGCAAACTGG-3＇，退火溫度58℃。PHD3引物：上游5＇-GTTCAGCCCTCCTATGC-3＇，下 游 5＇-ACCACCGTCAGTCTTTA-3＇，退火溫度57℃。β-Actin引物：上游 5＇-CTTTCTACAATGAGCTGCGTG-3＇，下 游5＇-TCATGAGGTAGTCTGTCAGG-3＇，退火溫度60℃。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，反應(yīng)30個循環(huán)，后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物1μg，1.2%瓊脂糖電泳，用生物電泳圖像分析系統(tǒng)（復(fù)日科技，F(xiàn)R-200）進(jìn)行分析，以待檢測指標(biāo)與β-actin吸光度（D）的比值來表示其相對含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用Bonferroni法。使用Stata 10.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

PHD2和PHD3在大鼠腎臟內(nèi)的生理性表達(dá)生理情況下PHD2和PHD3在腎臟內(nèi)均有一定量的表達(dá)，半定量評分結(jié)果：PHD2在皮質(zhì)為1.2±0.3，在髓質(zhì)為1.4±0.4；PHD3在皮質(zhì)為2.1±0.4，在髓質(zhì)為1.9±0.3。PHD2和PHD3均主要位于皮質(zhì)遠(yuǎn)端小管和髓質(zhì)集合管；不同的是，PHD2位于胞質(zhì)，而PHD3在胞質(zhì)和胞核均存在（圖1）。

圖1 PHD2和PHD3在大鼠腎臟中的生理性表達(dá)Fig 1 The physiologic expressions of PHD2 and PHD3 in renal kidneyA：PHD2 expression in cortex；B：PHD2 expression in medulla；C：PHD3 expression in cortex；D：PHD3 expression in medulla；E：PHD2 was expressed only in cytoplasm；F：PHD3 was expressed both in cytoplasm and nucleus （IHC，A-D：×200，E-F：×400）.Red arrows：Positive staining of PHD2 and PHD3 in the kidney.

5/6腎切除大鼠腎功能和病理變化腎切除后第1周RK大鼠出現(xiàn)了短暫的急性腎衰竭，之后Scr下降并進(jìn)入穩(wěn)定的慢性腎衰竭階段，較多腎小管增生和代償性肥大，部分小管上皮細(xì)胞萎縮、管腔擴(kuò)張，間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤；第6周后Scr進(jìn)行性升高，小管間質(zhì)損傷加重；第8至12周時大量小管結(jié)構(gòu)消失，殘存小管代償性擴(kuò)張，間質(zhì)大量纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤[9]。

PHD2和PHD3在5/6腎切除大鼠腎病進(jìn)展中的表達(dá)為研究RK大鼠病程不同階段PHD2和PHD3的表達(dá)變化，我們首先對腎切除術(shù)后第1、2、4、6、8、12周的腎皮質(zhì)進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHD2在腎切除術(shù)后表達(dá)逐漸增加，至術(shù)后第6周時達(dá)到峰值，此后表達(dá)明顯減少，第12周時降至基線水平；PHD3在腎切除后表達(dá)亦逐漸增加，第4周時達(dá)到峰值，此后表達(dá)逐漸減少但仍維持較高水平（圖2）。對上述不同時間點(diǎn)的腎皮質(zhì)進(jìn)行Western blot檢測和RT-PCR檢測也證實(shí)了上述結(jié)果（圖3）。由此可見，RK大鼠腎臟皮質(zhì)PHD2和PHD3的表達(dá)較健康大鼠有不同程度的增加，且以PHD3表達(dá)為主。

不同時機(jī)L-Mim治療對5/6腎切除大鼠腎病進(jìn)展的作用各組RK大鼠在體重和收縮壓方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與未治療的RK組相比，RK+LM2-12組的Scr和24 h Ualb均增加（P＜0.01），而BUN和血紅蛋白（hemoglobin，Hb）的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；RK+LM4-12組的BUN、Scr降低和24 h Ualb（P＜0.01），Hb增加（P＜0.05）；RK+LM8-12組的BUN、Scr、24 h Ualb和 Hb與RK組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

RK+LM2-12組的腎小球硬化指數(shù)和小管間質(zhì)損傷指數(shù)均高于RK組（P＜0.05），RK+LM4-12組的上述指數(shù)均低于RK組（P＜0.01），RK+LM8-12組與RK組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

不同時機(jī)L-Mim治療對5/6腎切除大鼠HIF-α的選擇性活化12周末各組PK大鼠殘腎皮質(zhì)HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)的 Western blot測定結(jié)果見圖5。RK+LM2-12組的HIF-1α蛋白表達(dá)高于RK組（P＜0.05），而 RK+LM4-12組和 RK+LM8-12組的HIF-1α蛋白表達(dá)與RK組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相反，RK+LM2-12組的HIF-2α蛋白表達(dá)高于 RK 組（P＜0.05），RK+LM4-12組的HIF-2α蛋白表達(dá)顯著高于RK組（P＜0.01），RK+LM8-12組的 HIF-2α蛋白表達(dá)與RK組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 5/6腎切除后腎組織中PHD2和PHD3的表達(dá)變化Fig 2 Expressions of PHD2 and PHD3 in remnant kidneyvs.0 wk group，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01.Red arrows：Positive staining of PHD2 and PHD3 in the kidney（IHC，×100）.

圖3 不同時間點(diǎn)RK大鼠PHD2和PHD3的m RNA和蛋白水平Fig 3 The mRNA and protein levels of PHD2 and PHD3 in RK rats at different time pointA：RT-PCR test；B：Western blot test.（1）vs.0 wk group，P＜0.05；（2）vs.0 wk group，P＜0.01.

表1 L-Mim治療時間對RK大鼠生化指標(biāo)的影響Tah 2 Functional effects of L-Mim administration on RK rats ±s）

表1 L-Mim治療時間對RK大鼠生化指標(biāo)的影響Tah 2 Functional effects of L-Mim administration on RK rats ±s）

（1）vs.sham group，P＜0.01；vs.RK group，（2）P＜0.05，（3）P＜0.01.

Remnant kidney groupsSham group（n=4）Biochemical indicatorsRK（n=5）RK+LM2-12（n=6）RK+LM4-12（n=6）RK+LM8-12（n=6）Body weight（g）416±11294±13（1）297±8（1）310±15（1）（2）290±13（1）SBP（mm Hg）98±3147±15（1）146±16（1）142±18（1）149±15（1）BUN （mmol/L）5.1±0.433.4±4.0（1）30.0±2.9（1）16.7±2.7（1）（2）31.4±4.6（1）Scr（μmol/L）23.4±2.8130.0±24.1（1）165.6±10.7（1）（3）82.4±6.3（1）（2）125.2±13.2（1）Hb（g/L）145.0±6.9100.2±7.6（1）97.4±8.0（1）118.6±12.7（1）（2）99.2±6.4（1）24 h Ualb（mg/d）0.3±0.1167.8±49.2（1）292.0±52.2（1）（2）68.6±8.9（1）（2）172.4±23.3（1）

圖4 L-Mim治療時間對RK大鼠腎皮質(zhì)組織形態(tài)學(xué)的影響Fig 4 Effects of L-Mim on glomerular and tuhular inJuries in RKA：RK group；B：RK+LM2-12group with early long-term treatment；C：RK+LM4-12group with advanced medium-term treatment；D：RK+LM8-12group with end-stage treatment （A-D：×100，PAS）；E：Glomerulosclerosis；F：Tubulointerstitial injury.（1）P＜0.05；（2）P＜0.01.

圖5 L-Mim治療時間對RK大鼠腎皮質(zhì)HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)的影響Fig 5 The effect of L-Mim administration maintained different length of time on the protein expressions of HIF-1αand HIF-2αin the cortex of RK ratsWestern blot test.vs.RK group，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01.

討 論

雖然氧濃度和PHD是調(diào)控HIF表達(dá)的關(guān)鍵因素，但PHD家族存在PHD1、PHD2和PHD3等不同亞型，HIF-α亞基也存在HIF-1α和HIF-2α等不同亞型。在不同的病理生理?xiàng)l件下及不同的臟器組織中，不同的PHD亞型對不同的HIF-α亞型的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)度不同[1-2，10]；作為轉(zhuǎn)錄因子，不同的HIF-α亞型也調(diào)控著作用不同甚至相反的下游因子的轉(zhuǎn)錄[1]。因此，采用PHD抑制劑促進(jìn)HIF高表達(dá)治療缺血缺氧性腎臟病這一方法變得復(fù)雜化。

目前發(fā)現(xiàn)在包括腎臟在內(nèi)的多種組織中，只有PHD2和PHD3受低氧調(diào)控明顯[2]，因此本研究僅測定PHD2和PHD3在腎臟中的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，生理?xiàng)l件下腎臟髓質(zhì)集合管和皮質(zhì)遠(yuǎn)端小管存在一定量的PHD2和PHD3表達(dá)，這與Sch?del等[11]的研究結(jié)果類似。由于腎臟髓質(zhì)在生理情況下血氧供應(yīng)較少，皮質(zhì)遠(yuǎn)端小管氧耗相對較大。氧供和氧耗的不平衡使得上述部位存在生理性低氧，而PHD2和PHD3也是接受低氧調(diào)控的HIF-α的下游基因[1-2]，這可能是腎臟內(nèi)存在生理性PHD2和PHD3表達(dá)的原因。而這種生理性表達(dá)所帶來的負(fù)反饋效應(yīng)可能是腎臟生理性低氧區(qū)域內(nèi)仍然鮮有HIF-1α和HIF-2α表達(dá)的原因之一。

以我們對HIF-α在CKD進(jìn)展過程中病理性表達(dá)變化的既往研究為基礎(chǔ)[9]，本研究以RK大鼠作為CKD動物模型，在HIF-α活化的不同階段分別給予PHD抑制劑L-Mim持續(xù)干預(yù)治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用L-Mim活化HIF對RK病程進(jìn)展起著“兩面性”的作用，既有保護(hù)性作用，也可能出現(xiàn)不良結(jié)果，這取決于藥物干預(yù)的時間：在腎切除早期立即給予持續(xù)L-Mim治療直至疾病終末期將加快腎功能惡化的進(jìn)程；在疾病進(jìn)展期給予持續(xù)L-Mim治療則可延緩病程進(jìn)展；晚期基于持續(xù)L-Mim治療已無法逆轉(zhuǎn)腎損傷。

PHD屬于2-酮戊二酸依賴的二氧酶家族，其特征是對Fe2+的絕對需求以及將2-酮戊二酸和分子氧作為協(xié)同底物[12]。HIF-α活化的經(jīng)典藥物鈷在廣義上也是一種PHD抑制劑，它通過螯合Fe2+抑制PHD，從而達(dá)到模擬低氧的效果。而L-Mim、DMOG以及3，4-DHB等PHD抑制劑則作為2-酮戊二酸類似物競爭性地抑制PHD活性。因此，理論上講，包括L-Mim在內(nèi)的上述藥物均是非選擇性的PHD抑制劑，它們可以同等程度地活化所有HIF-α亞型。但研究結(jié)果并非如此。早期有關(guān)鈷對CKD作用的研究發(fā)現(xiàn)鈷的腎臟保護(hù)作用與HIF-1α活化有關(guān)，但未研究其與HIF-2α的關(guān)系[3，5]。而近期在糖尿病腎病大鼠中發(fā)現(xiàn)鈷可以同步上調(diào)腎臟內(nèi)HIF-1α和HIF-2α表達(dá)[6]。但是，對于正常腎臟和急性缺血后的腎臟，采用包括L-Mim在內(nèi)的非選擇PHD抑制劑可以更多地活化HIF-1α，而較少活化HIF-2α[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，早期給予RK大鼠持續(xù)L-Mim治療以活化HIF-1α為主，對HIF-2α的作用不明顯，而在疾病進(jìn)展期給予持續(xù)L-Mim治療則選擇性地活化了HIF-2α，對HIF-1α無顯著影響。由此可見，在不同的病理生理?xiàng)l件下，非選擇性PHD抑制劑可以選擇性地活化腎臟內(nèi)的HIF-1α和HIF-2α。

關(guān)于非選擇性的PHD抑制劑可以選擇性地活化HIF-α亞型的機(jī)制目前仍然不明確。不同PHD亞型對不同HIF-α亞型的羥基化作用強(qiáng)度不同，如PHD2對 HIF-1α的羥基化作用強(qiáng)于 HIF-2α，而PHD3對HIF-2α的羥基化作用強(qiáng)于HIF-1α[10]；在不同的病理生理?xiàng)l件下及不同的組織臟器中，PHD亞型的分布強(qiáng)弱也不同。因此，非選擇性PHD抑制劑可以選擇性地活化HIF-α亞型。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在RK病程進(jìn)展期PHD3表達(dá)較健康大鼠明顯增加且明顯高于PHD2，這可能是進(jìn)展期LMim治療選擇性地活化了HIF-2α的原因之一。

目前已明確的HIF下游基因已達(dá)100余種，但在特定的情況下、特定的組織細(xì)胞內(nèi)，僅有部分基因可以被轉(zhuǎn)錄，而且HIF-1α和HIF-2α對這些基因的轉(zhuǎn)錄能力不全相同[1]，如具有抗凋亡和募集內(nèi)皮祖細(xì)胞等功能的EPO是明確的HIF-2α的下游基因；而與纖維化相關(guān)的CTGF是明確的HIF-1α的下游基因，HIF-1α基因敲除后的UUO小鼠腎臟內(nèi)纖維化程度明顯減輕[7]。由此我們推測，在本研究中進(jìn)展期L-Mim治療可能通過促進(jìn)HIF-2α的活化來上調(diào)EPO等保護(hù)性下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而延緩病程進(jìn)展；而早期持續(xù)L-Mim治療可能促進(jìn)了HIF-1α的持續(xù)活化使得CTGF等與纖維化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄增加，從而惡化了腎功能。

本研究結(jié)果提示，在RK大鼠病程進(jìn)展的不同階段給予PHD抑制劑L-Mim治療可以對腎功能產(chǎn)生“兩面性”的作用，即治療時機(jī)恰當(dāng)可以有效延緩病情進(jìn)展，而治療不當(dāng)則加快腎功能惡化。這可能與PHD2和PHD3在不同時機(jī)的差異性表達(dá)使得PHD抑制劑選擇性活化了不同HIF-α亞型有關(guān)。因此，選擇PHD抑制劑治療CKD需要考慮治療時機(jī)以及被活化的HIF-α亞型。

[1] Rosenberger C， Rosen S， Heyman SN.Current understanding of HIF in renal disease[J].Kidney Blood Press Res，2005，28（5-6）：325-340.

[2] Bruick RK，Mc Knight SL.A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF[J].Science，2001，294（5545）：1337-1340.

[3] Tanaka T，Kojima I，Ohse T，et al.Cobalt promotes angiogenesis via hypoxia-inducible factor and protects tubulointerstitium in the remnant kidney model[J].Lab Invest，2005，85（10）：1292-1307.

[4] Song YR，You SJ，Lee YM，et al.Activation of hypoxiainducible factor attenuates renal injury in rat remnant kidney[J].Nephrol Dial Transplant，2010，25（1）：77-85.

[5] Tanaka T，Matsumoto M，Inagi R，et al.Induction of protective genes by cobalt ameliorates tubulointerstitial injury in the progressive Thy1 nephritis[J].Kidney Int，2005，68（6）：2714-2725.

[6] Ohtomo S，Nangaku M，Izuhara Y，et al.Cobalt ameliorates renal injury in an obese，hypertensive type 2 diabetes rat model[J].Nephrol Dial Transplant，2008，23（4）：1166-1172.

[7] Higgins DF，Kimura K，Bernhardt WM，et al.Hypoxia promotes fibrogenesisin vivovia HIF-1 stimulation of epithelial-to-mesenchymal transition[J].J Clin Invest，2007，117（12）：3810-3820.

[8] Higgins DF，Kimura K，Iwano M，et al.Hypoxia-inducible factor signaling in the development of tissue fibrosis[J].Cell Cycle，2008，7（9）：1128-1132.

[9] 俞小芳，朱加明，丁小強(qiáng)，等.5/6腎切除大鼠低氧誘導(dǎo)因子1α和2α在腎內(nèi)的表達(dá)和定位 [J].中華腎臟病雜志，2010，26（9）：689-695.

[10] Appelhoff RJ，Tian YM，Raval RR，et al.Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1，PHD2，and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor[J].J Biol Chem，2004，279（37）：38458-38465.

[11] Sch?del J，Klanke B，Weidemann A，et al.HIF-prolyl hydroxylases in the rat kidney：physiologic expression patterns and regulation in acute kidney injury[J].Am J Pathol，2009，174（5）：1663-1674.

[12] Siddiq A，Aminova LR，Ratan RR.Hypoxia inducible factor prolyl 4-hydroxylase enzymes：center stage in the battle against hypoxia，metabolic compromise and oxidative stress[J].Neurochem Res，2007，32（4-5）：931-946.

[13] Warnecke C，Griethe W，Weidemann A，et al.Activation of the hypoxia-inducible factor-pathway and stimulation of angiogenesis by application of prolyl hydroxylase inhibitors[J].FASEB J，2003，17（9）：1186-1188.

[14] Hill P，Shukla D，Tran MG，et al.Inhibition of hypoxia inducible factor hydroxylases protects against renal ischemia-reperfusion injury[J].J Am Soc Nephrol，2008，19（1）：39-46.

Expression of prolyl hydroxylase domain enzyme（PHD）in rat kidney and the effect of PHD inhihitor on rats with 5/6 remnant kidney

YU Xiao-fang，CAI Jie-ru，CUI Meng，LIU Shao-peng，F(xiàn)ANG Yi，ZOU Jian-zhou，DING Xiao-qiang△
（Department of Nephrology，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai200032，China）

prolyl hydroxylase domain enzyme（PHD）； hypoxia-inducible factor-α（HIF-α）；remnant kidney； SD rat

special administration of PHD inhibitor L-mimosine（L-Mim）as follows：early longterm L-Mim treatment group were administered at weeks 2-12；advanced medium-term L-Mimtreatment group were administered at weeks 4-12，and end-stage L-Mim treatment group were administered at weeks 8-12.ResultsModerate amount of PHD2 and PHD3 were physiologically expressed in distal tubules of the cortex and tubules of the medulla.PHD2 and PHD3 expressions were gradually increased during the early stage after nephrectomy.PHD2 level peaked at week 6，and then gradually decreased until the baseline at week 12.PHD3 level peaked at week 4，and then maintained at a high level.Compared with control group，renal dysfunction was exacerbated by early long-term L-Mim treatment，and improved by advanced medium-term L-Mim treament.End-stage L-Mim treatment had no effect on RK rats.Compared with control group，early long-time L-Mim treatment up-regulated hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）level（P＜0.05），while advanced medium-term and end-stage LMim treatment had no effect on HIF-1αexpression.Campared with control group，early long-term LMim treatment up-regulated HIF-2αlevel（P＜0.05），and advanced medium-term L-Mim treatment also up-regulated HIF-2αlevel significantly（P＜0.01），while end-stage L-Mim treatment had no effect on HIF-2αexpression.ConclusionsThe expression of PHD2 and PHD3 were different during the progression of RK.PHD inhibitor L-Mim has dual roles in the development of CKD depending on the timing of the administration and possibly the activated isoform of HIF-α.

2013-04-26；編輯：段佳）

上海市科委基礎(chǔ)研究重大項(xiàng)目（12DJ1400200）；國家自然科學(xué)基金（81000307，81100524）

△Corresponding author E-mail：ding.xiaoqiang@zs-hospital.sh.cn

R 692

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.009

*This work was supported hy the MaJor ProJect of Basic Research of Technology Committee in Shanghai of China（12DJ1400200）and the National Natural Science Foundation of China（81000307，81100524）

【Ahstract】 OhJectiveTo characterize prolyl hydroxylase domain enzyme （PHD）expression in physiologic state and during the development of chronic kidney disease（CKD），and to investigate the effect of PHD inhibitor on CKD.MethodsRats with remnant kidney（RK rats）were sacrificed at week 0，1，2，4，6，8，12 after subtotal nephrectomy.An additional group of RK rats were randomized and each