清腸溫中方對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜作用的研究

劉麗娟 王允亮 史瑞 魏仕兵 楊美娟 李軍祥

·論著·

清腸溫中方對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜作用的研究

劉麗娟 王允亮 史瑞 魏仕兵 楊美娟 李軍祥

目的研究清腸溫中方對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜的作用。方法以三硝基苯磺酸灌腸誘導(dǎo)大鼠急性結(jié)腸炎，造模成功后連續(xù)以清腸溫中方高、中、低劑量混懸液及柳氮磺吡啶(salazosulfapyridine，SASP)混懸液灌胃治療10天，取結(jié)腸，進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)，結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colonic mucosa damage index, CMDI)和結(jié)腸組織病理學(xué)(histological score, HS)評(píng)價(jià)。結(jié)果藥物干預(yù)10天后，模型組DAI、CMDI、HS明顯高于正常組(P<0.05)；SASP組DAI及CMDI均較模型組有明顯的下降(P<0.05)；清腸溫中方各劑量組DAI、CMDI、HS水平較模型組均明顯下降(P<0.05),其中清腸溫中方高、中劑量組炎細(xì)胞侵潤(rùn)的程度明顯低于模型組(P<0.05)。結(jié)論清腸溫中方對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠腸黏膜有保護(hù)作用，且能有效改善結(jié)腸組織炎細(xì)胞侵潤(rùn)。

清腸溫中方; 疾病活動(dòng)指數(shù); 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù); 病理學(xué)評(píng)價(jià); 炎性侵潤(rùn)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組特發(fā)性、慢性、炎癥性腸道疾病狀態(tài)，包括克羅恩病(Crohn`s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)[1]。IBD過(guò)去常見于發(fā)達(dá)國(guó)家，近幾十年發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率逐步上升[2]。中醫(yī)藥對(duì)IBD的治療有著明顯的優(yōu)勢(shì)[3]。清腸溫中方在臨床IBD的治療中有著顯著的療效，本研究擬在觀察清腸溫中方對(duì)2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-Benzenesulfonic acid, TNBS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性SD大鼠，46只，體重(200±20)g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]，常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，12小時(shí)光照/黑夜循環(huán)，溫度(22±2)℃，濕度50～60%；自由飲食飲水飼養(yǎng)。

清腸溫中方配方顆粒(黃連9 g、炮姜9 g、三七6 g、木香6 g、炙甘草3 g等)購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒藥房；柳氮磺吡啶片(SASP，上海中西三維藥業(yè)有限公司)購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房；TNBS，5%(w/v)購(gòu)自sigma(P2297)，冰乙酸(NO.81601)、鄰甲聯(lián)苯胺(NO.61805)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與造模

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為正常組(5只)、模型組(10只)、柳氮磺吡啶組(400 mg/kg，10只)、高劑量組(清腸溫中方生藥量1200 mg/kg，10只)、中劑量組(清腸溫中方生藥量600 mg/kg，10只)、低劑量組(清腸溫中方生藥量300 mg/kg，10只)。采用TNBS/乙醇復(fù)合法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠模型[4]。造模前大鼠禁食不禁水24小時(shí)，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，將乳膠軟管液體石蠟潤(rùn)滑后由肛門緩慢輕插入直腸約8 cm，一次性緩慢推注含33.3%乙醇的TNBS溶液(100 mg/kg)0.6 ml，1分鐘之內(nèi)完成，保持仰臥位臀部向上15分鐘，空白組灌入等量去離子水，自然蘇醒后放回籠中，常規(guī)飼養(yǎng)。造模3天后隨即取5只大鼠處死后觀察結(jié)腸以確定造模成功。造模第4天連續(xù)給予相應(yīng)藥物灌胃治療10天，模型組及正常組以去離子水對(duì)照，10 ml/kg，每天觀察大鼠一般狀況，稱取體重，檢測(cè)大便潛血，觀察大便一般性狀。以造模第一天為DAY1，灌胃結(jié)束為DAY13。

1.3 標(biāo)本采集與處理

末次給藥后，禁食不禁水24小時(shí)準(zhǔn)備結(jié)腸，10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，常溫放置3小時(shí)后離心分離血清(3000 rpm，10分鐘)，分裝后-20℃凍存?zhèn)溆?；分離遠(yuǎn)端結(jié)腸10 cm，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，冰PBS沖洗后觀察結(jié)腸黏膜損傷情況；取結(jié)腸損傷明顯處1 cm×1 cm放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片4 μm，HE染色觀察病理。

1.4 疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)

便潛血采用鄰甲聯(lián)苯胺法檢測(cè)[5]：取2～3滴0.15 L/L鄰甲聯(lián)苯胺冰乙酸溶液滴于糞便上，滴加3%過(guò)氧化氫2～3滴，立即觀察結(jié)果，在2分鐘內(nèi)顯藍(lán)色為陽(yáng)性。疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分[6]：體質(zhì)量：0分無(wú)下降，1分下降1%～5%，2分下降5%～10%，3分下降10%～15%，4分下降>15%；大便性狀：0分正常，2分松散，4分腹瀉；大便隱血：0分無(wú)，2分陽(yáng)性，4分肉眼血便。DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+隱血分?jǐn)?shù))/3。

結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colonic mucosa damage index，CMDI)評(píng)分[7]：0分無(wú)損傷；1分無(wú)潰瘍；2分腸壁變厚，無(wú)潰瘍；3分有潰瘍，直徑<1 cm；4分有潰瘍，直徑>1 cm，腸管與周圍組織無(wú)粘連；5分有潰瘍，直徑>1 cm，腸管與周圍組織有粘連。CMDI、DAI評(píng)估均由非課題組成員完成。

1.5 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

石蠟切片常規(guī)HE染色，封片。結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分(histological score, HS)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]：HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察評(píng)分，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(inflammatory infiltration, II)：0分無(wú)炎細(xì)胞侵潤(rùn)，1分輕度，2分重度；肉芽腫：0分無(wú)，1分輕，2分重；病變深度：0分黏膜層，1分黏膜下層，2分肌層，3分漿膜層，計(jì)算總分，每個(gè)樣本隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)算平均分。HS評(píng)估均由非課題組成員在病理老師指導(dǎo)下完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況及DAI

造模后第2天，模型組大鼠出現(xiàn)腹瀉，為黃色稀便、半稀便甚至血便。大鼠毛色失去光澤，活動(dòng)性差，反應(yīng)遲緩、懶動(dòng)，至第3天DAI到最大。

第5天(總第7天，DAY7)各用藥組大鼠精神好轉(zhuǎn)，毛色漸有光澤，食欲增加，活動(dòng)逐漸增多，大便逐漸正常，DAI明顯下降(P<0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，用藥第5天(總第7天，DAY7)到用藥10天(總第13天，DAY13)DAI的恢復(fù)較為緩慢，無(wú)明顯差別(P>0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))?？瞻捉M大鼠則無(wú)上述精神、食欲、活動(dòng)、毛色等情況，如表1。藥物干預(yù)10天后，模型組DAI仍明顯高于正常組(P=0.003<0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，SASP組及清腸溫中方各劑量組均較模型組有明顯的下降(P<0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，清腸溫中方高中低劑量組DAI水平較SASP組無(wú)明顯差異(P>0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，如表2。死亡情況：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白組無(wú)死亡，模型組死亡4只，柳氮磺吡啶組死亡1只，清腸溫中方高劑量組死亡3只，中劑量組死亡2只，低劑量組死亡1只。

表1 DAI日變化表

注：與DAY3比較，aP<0.05,bP>0.05；與DAY7比較，cP<0.05,dP>0.05；與空白組比較，eP<0.05；與模型組比較，fP<0.05；與SASP組比較，gP>0.05

2.2 大鼠結(jié)腸CMDI

模型組肉眼可見結(jié)腸黏膜糜爛重，潰瘍較深而且面積較大，潰瘍處有明顯腸內(nèi)容物嵌入，不易沖洗；可見明顯水腫，充血，結(jié)腸表面覆蓋有紅褐色炎癥性偽膜；結(jié)腸病變處腸腔擴(kuò)張變形；結(jié)腸與周圍組織粘連明顯，不易分離。各用藥組結(jié)腸與周圍組織粘連較輕，結(jié)腸表面未見紅褐色炎癥性偽膜，充血、水腫減輕，潰瘍呈愈合性表現(xiàn)。用藥10天后，模型組CMDI仍明顯高于空白組(P=0.003<0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，SASP組及清腸溫中方中劑量組較模型組均明顯下降(P<0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，此二組CMDI水平無(wú)明顯差異(P=0.671>0.05)，非參數(shù)檢驗(yàn))，如表2。

表2 清腸溫中方對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠CMDI的影響

注：與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與SASP組比較,cP>0.05

2.3 大鼠結(jié)腸病理

模型組光鏡下可見黏膜充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主，病變深度達(dá)黏膜下層、肌層甚至漿膜層；杯狀細(xì)胞明顯減少，潰瘍周圍的部分腺體擴(kuò)張,腺體排列紊亂，部分腺上皮細(xì)胞輕度增生及非典型增生，可見炎癥性肉芽腫。各治療組光鏡下可見充血、水腫減輕，炎細(xì)胞侵潤(rùn)減輕，以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主，中性粒細(xì)胞少見，個(gè)別結(jié)腸組織可見嗜酸性粒細(xì)胞，炎細(xì)胞侵潤(rùn)層次變淺，集中在黏膜下層，如圖1。模型組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于空白組(P=0.001<0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，清腸溫中方各個(gè)劑量組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均明顯低于模型組(P<0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，其中清腸溫中方高、中劑量組炎細(xì)胞侵潤(rùn)的程度明顯低于模型組(P<0.05，非參數(shù)檢驗(yàn))，如表3。

表3 清腸溫中方對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠病理的影響

注：與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05

A 空白組 B 模型組 C SASP組 D 高劑量組 E 中劑量組 F 低劑量組

3 討論

IBD在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率逐年升高，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)IBD的治療局限于氨基水楊酸(水楊酸偶氮磺胺吡啶等)、皮質(zhì)固醇類激素，及免疫調(diào)節(jié)劑、微生物制劑及生物靶向治療。氨基水楊酸類及激素類藥物具有較大臨床副作用及逐年出現(xiàn)的難治性IBD[9]，免疫調(diào)節(jié)劑、微生物制劑及生物靶向治療方法等新興的治療方法其臨床療效仍有待證據(jù)支持[10]，這些都限制了IBD的臨床治療。中醫(yī)藥療效的顯著性使得越來(lái)越多研究關(guān)注IBD的中醫(yī)藥治療。

清腸溫中方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院消化內(nèi)科李軍祥教授經(jīng)過(guò)多年臨床總結(jié)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床以腹瀉，黏液膿血便，腹痛，里急后重為主癥，李軍祥教授認(rèn)為其病機(jī)是脾虛為本，腸道濕熱為標(biāo)，病機(jī)關(guān)鍵為寒熱錯(cuò)雜，濕熱瘀阻，治療當(dāng)清腸溫中，化瘀止血，制定清腸溫中方，治療臨床潰瘍性結(jié)腸炎取得很好的效果。本方主要由黃連、炮姜、三七等藥組成，方中黃連苦寒入血分，具有清腸止血的功效，炮姜既可溫脾止瀉，又可制黃連等諸藥之苦寒，三七化瘀止血，諸藥合用能起到清利腸道濕熱，溫中健脾，平調(diào)寒熱，化瘀止血的效果。現(xiàn)代研究顯示黃連的主要成分黃連素及其總生物堿均具有顯著的抗?jié)兗翱咕饔肹11]，黃連總堿能通過(guò)抗氧化自由基、抑制炎細(xì)胞活性對(duì)動(dòng)物結(jié)腸炎起到治療作用[12]。炮姜水溶物能有效縮短小鼠的出血時(shí)間[13]?；诖吮狙芯拷M從結(jié)腸黏膜保護(hù)觀察清腸溫中方對(duì)IBD的作用。

本研究中以TNBS作用于SD大鼠構(gòu)建類似于人類發(fā)病及癥狀的IBD動(dòng)物模型，以清腸溫中方高中低劑量治療動(dòng)物模型，觀察清腸溫中方對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的作用。TNBS造模3天后大鼠均出現(xiàn)明顯的血便，大便稀溏，形體消瘦，懶動(dòng)，毛發(fā)無(wú)光澤等急性結(jié)腸炎癥的表現(xiàn)[4]，且DAI指數(shù)明顯增高，證明結(jié)腸炎動(dòng)物模型構(gòu)建成功。10天后，模型組CMDI及DAI下降，但較空白組仍有明顯的差異，可見TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型有一定的自愈性，但10天并不能完全愈合。藥物干預(yù)后清腸溫中方對(duì)結(jié)腸炎大鼠CMDI、DAI、HS均有明顯的改善作用，其中以中劑量組效果最為明顯(P<0.05)，清腸溫中方高、中劑量組炎細(xì)胞侵潤(rùn)的程度明顯低于模型組(P<0.05)，可見清腸溫中方對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸黏膜有保護(hù)作用，能有效改善結(jié)腸炎細(xì)胞侵潤(rùn)，明顯的改善疾病癥狀，可以起到一定的治療作用，但作用機(jī)制并不明確，有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：黃凡)

EffectofQingchangWenzhongDecoctiononcolonicmucosaofTNBS-inducedcolitisrats

LIULi-juan,WANGYun-liang,SHIRui,etal.

DepartmentofGastroenterology,DongfangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China

LIJun-xiang,E-mail:lijx970508@sohu.com

ObjectiveTo explore the effect of Qingchang Wenzhong Decoction(QCWZD)on colonic mucosa on a rat model of experimental inflammatory bowel disease (IBD).MethodsColitis was induced in male sprague-dawley (SD) rats by intracolonic administration of 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), 100 mg/kg. QCWZD preparation and salazosulfapyridine (SASP) was given by gavage route daily for 10 days. Disease activity index(DAI), colonic mucosa damage index(CMDI), histological score(HS)were estimated.ResultsDAI, CMDI, HS was significantly higher in TNBS-treated rats (P<0.05); DAI and CMDI decreased in SASP-treated TNBS-induced colitis rats (P<0.05). QCWZD preparation reduced DAI,CMDI and HS of TNBS-induced rats (P<0.05); QCWZD preparation(1200 mg/kg, 600 mg/kg)reduced inflammatory infiltration(II) of colon(P<0.05).ConclusionsData obtained indicated that QCWZD could protect colonic mucosa by reducing inflammatory infiltration.

Qingchang Wenzhong Decoction; Disease activity index; Colonic mucosa damage index; Histological score; Inflammatory infiltration

北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(2011-CXTD-24)

100078 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院脾胃肝膽科[劉麗娟(博士研究生)、王允亮(博士研究生)、史瑞、魏仕兵(碩士研究生)、李軍祥]；北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(楊美娟)

劉麗娟(1984-)，女，2012級(jí)在讀博士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治慢性胃腸道疾病。E-mail: ljliu609@163.com

李軍祥(1964-)，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治慢性肝膽和胃腸道疾病。E-mail: lijx970508@sohu.com

R254.6

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.03.006

2013-12-03)