鈦種植體表面構(gòu)筑多級微/納米活性結(jié)構(gòu)的研究

王世強,陳艷文,王周成

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,福建 廈門 361005)

鈦及其合金作為一種具有良好耐腐蝕性和生物相容性的生物材料[1-3],其彈性模量接近于成骨[4],不易產(chǎn)生應(yīng)力屏蔽[5],被廣泛應(yīng)用于種植體[3,5]．而如何實現(xiàn)材料植入后,短時間內(nèi)即與周圍骨組織實現(xiàn)機械鎖合和化學(xué)鍵合,從而實現(xiàn)形成骨融合[6],同時保證材料與組織的長期穩(wěn)定,對生物材料的應(yīng)用有著重要的意義．許多學(xué)者認(rèn)為,一定粗糙度的微米級形貌表面有利于比表面積的增加、成骨細(xì)胞的分化和細(xì)胞外基質(zhì)的形成和礦化[7],同時能為組織和細(xì)胞生長提供支架,增大成骨細(xì)胞與材料的附著力[8-9]；而納米級形貌有利于某些蛋白的合成和吸附,從而促進成骨細(xì)胞的黏附[10-11]．為了在鈦表面構(gòu)筑多級形貌結(jié)構(gòu),從而利于種植體的短期負(fù)載和長期穩(wěn)定,本實驗采用噴砂酸蝕和陽極氧化的方法,在純鈦表面構(gòu)筑多級微/納米結(jié)構(gòu),經(jīng)過相應(yīng)的高溫?zé)崽幚?進而在表面獲得親水性好、生物活性佳的活性表面,以此達到增加種植體的作用面積、優(yōu)化其表面生物活性的目的．

1 實驗方法

1.1 鈦的表面處理

選用工業(yè)級的TA2級純鈦片(10 mm×10 mm×1 mm)進行預(yù)處理,經(jīng)Al2O3砂紙逐級打磨至劃痕均勻后,依次浸入丙酮、乙醇和去離子水中室溫下超聲清洗10 min作除油處理,后置于V(65%HNO3)∶V(40%HF)∶V(去離子水)=3∶1∶2配比的溶液中酸洗2 min．將預(yù)處理后樣品分為4組．1) 酸洗對照組(control):選用打磨除油酸洗2 min的樣品作為對照組；2) 噴砂酸蝕組(sandblasting and acid-etching,SLA):經(jīng)打磨除油酸洗2 min后,表面采用180目Al2O3(粒徑約80 μm)噴砂,壓力為0.5 MPa,距離為1 cm,除油處理后置于V(98%H2SO4)∶V(37%HCl)=3∶1混合液中,60 ℃下酸蝕30 min；3) 噴砂酸蝕-陽極氧化組(SLA-anodizing,SLA-A):以噴砂酸蝕處理后的鈦樣品為陽極,鉑片為陰極,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的HF溶液體系中,20 V電壓,30 ℃進行陽極氧化3 min；4) 噴砂酸蝕-陽極氧化熱處理組(SLA-A-heating,SLA-A-H):噴砂酸蝕陽極氧化后樣品置于管式爐中,在400 ℃下保溫?zé)崽幚? h．

4組樣品進行相應(yīng)處理后,均用大量去離子水沖洗,40 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量,備用．

1.2 表面表征及成分分析

采用德國LEO公司生產(chǎn)的LEO-1530場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM,加速電壓20 kV)及其帶有的Oxford能量散射光譜儀(EDS)觀察樣品表面的形貌及化學(xué)元素組成;采用Rigaku公司生產(chǎn)UltimaⅣ射線衍射儀(XRD,Cu-Kα靶,管電壓30 kV,管電流15 mA)分析表面的物相組成;采用KRUSS公司生產(chǎn)的DSA30接觸角測量儀測試表面的靜態(tài)接觸角．

1.3 體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗

將打磨除油酸洗鈦片(control)設(shè)為對照組,SLA、SLA-A、SLA-A-H鈦片設(shè)為表面處理組．37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2下培養(yǎng)MG-63(人成骨肉瘤)細(xì)胞生長鋪展到80%～90%,使用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)洗滌2次,加入2.5 mg/mL胰酶消化后,培養(yǎng)液終止反應(yīng)并制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度到1×105mL-1時,接種至對照組和表面處理組的鈦片表面．置于37 ℃、5%CO2飽濕適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．觀察細(xì)胞培養(yǎng)第3天,使用PBS溶液清洗去除未黏附細(xì)胞,2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定2 h,預(yù)冷PBS溶液清洗后分別以體積分?jǐn)?shù)為30%,50%,70%,90%,100%的乙醇依次梯度脫水每次10 min,最后過渡到100%叔丁醇中,4 ℃過夜結(jié)晶,冷凍干燥后用離子濺射鍍膜技術(shù)表面噴金,通過SEM觀察細(xì)胞在材料表面生長、黏附狀況．

2 結(jié)果與討論

2.1 表面形貌

圖1為純鈦表面經(jīng)不同方式處理后的表面SEM圖．圖1(a)為鈦基體經(jīng)打磨酸洗預(yù)處理后的表面形貌,酸洗去除鈦表面氧化膜,形成略帶棱角的相對平整表面,高放大倍數(shù)下(圖1(b))可以觀察到相對光滑、潔凈的表面．酸洗表面經(jīng)噴砂酸蝕處理后(圖1(c)和(d))形成了豐富的表面形貌,圖中顏色較暗的部分為凹陷區(qū),存在砂粒撞擊形成的10～20 μm不均勻的凹陷,凹陷中存在酸蝕形成的5～8 μm的微米級孔洞結(jié)構(gòu),高放大倍數(shù)下可見表面相對潔凈,無明顯的銳利邊緣,從而在一定程度上形成了多級微米的SLA表面．隨后,對SLA表面進行陽極氧化,由圖1(e)和(f)可見,噴砂酸蝕形成的多級微米級形貌基本上無明顯變化,仍為明顯的不均勻凹陷和酸蝕孔洞,高放大倍數(shù)下可見在噴砂酸蝕后的表面生成了一層連續(xù)且規(guī)則排列的納米級結(jié)構(gòu),其納米管直徑約為10 nm,說明通過噴砂酸蝕加陽極氧化的處理方法構(gòu)造了多級微/納米表面形貌．對形成的多級微/納米結(jié)構(gòu)作相應(yīng)的熱處理后(如圖1(g)和(h)所示),其表面多級形貌基本上無明顯變化,依然保持了多級微/納米的復(fù)合結(jié)構(gòu)形貌．

2.2 表面結(jié)構(gòu)和成分

對不同處理后的樣品成分進行能譜分析,如圖2所示.能譜顯示酸洗后表面為純鈦(圖2(a));經(jīng)Al2O3噴砂后,表面有大量的Al2O3砂粒夾雜,而之后的酸蝕處理表面將夾雜的Al2O3等大量溶解,純鈦基體裸露出來,顯示為單一的純鈦成分(圖2(b));在此表面上進行相應(yīng)的陽極氧化,能譜結(jié)果表明表面為Ti(質(zhì)量分?jǐn)?shù)72.95%,下同)、O(27.05%)元素(圖2(c)),說明純鈦基體作為陽極在氧化過程中,形成了鈦的氧化物；陽極氧化后樣品熱處理2 h后,氧化膜顏色由淺灰色變?yōu)闇\紫色,能譜結(jié)果顯示含有Ti(65.75%)、O(34.25%)(圖2(d)),說明在熱處理過程中,鈦與空氣中的氧氣發(fā)生氧化作用,使得氧化膜的厚度增加,氧質(zhì)量分?jǐn)?shù)進一步提高．

如圖3所示,采用XRD對表面晶型進行表征,酸洗和噴砂酸蝕后的純鈦表面,基本為純鈦的衍射峰；陽極氧化后,相比于純鈦表面,衍射峰亦無明顯變化,結(jié)合能譜中氧質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,說明陽極氧化過程中生成了無定形的氧化鈦；而對無定形的氧化鈦經(jīng)400 ℃熱處理后,XRD譜在25°左右出現(xiàn)銳鈦礦相(101) 的特征衍射峰,說明表面氧化鈦由無定形轉(zhuǎn)變?yōu)殇J鈦礦型二氧化鈦,SLA-A-H表面二氧化鈦結(jié)晶度較SLA-A得到了明顯提高．

2.3 親水性能

圖4為不同處理后干燥0.5 h所測得的接觸角．酸洗后純鈦表面為親水性,表面接觸角為(62.9±0.8)°(圖4(a));噴砂后酸蝕溶解了表面夾雜的Al2O3,在表面成分不發(fā)生改變情況下,樣品表面粗糙度增加,導(dǎo)致接觸角略微增加到(69.9±1.3)°(圖4(b));陽極氧化處理后,接觸角進一步減少,基本上能鋪展表面,為超親水表面(圖4(c));熱處理后,較未熱處理的SLA-A接觸角基本無明顯變化(圖4(d))．這說明通過在基體上進行多級微/納米形貌的構(gòu)造,基體表面的親水性能得到大幅度提高．

SLA后的陽極氧化是場致氧化,即在電場作用下發(fā)生反應(yīng):

2H2O →2O2-+4H+，

Ti →Ti2++2e，

Ti2++2O2-→TiO2+2e.

(a),(b) control;(c),(d) SLA;(e),(f) SLA-A;(g),(h) SLA-A-H.圖1 不同處理后的鈦樣品表面SEM圖Fig.1 SEM photographs of Ti samples prepared by different treatments

圖2 不同處理后鈦表面EDS譜圖Fig.2 EDS patterns of Ti samples prepared by different treatments

圖3 不同處理后鈦表面XRD譜圖Fig.3 XRD patterns of Ti samples prepared by different treatments

這是SLA-A能表現(xiàn)出超親水性能的主要原因．反應(yīng)初期在金屬表面形成一層初始氧化層,此后O2-向金屬/氧化物界面遷移,繼續(xù)與金屬反應(yīng)生成TiO2,Ti4+向氧化物/電解液界面遷移產(chǎn)生氧空位,游離的水分子被吸附到缺陷位,形成羥基組,羥基組進一步吸附水分子,形成物理吸附層,從而產(chǎn)生親水表面．親水性種植體在生物體內(nèi)表面不易形成血栓、血塊,新鮮循環(huán)的血液有利于植入體表面的礦化從而促進與骨質(zhì)的結(jié)合,也在一定程度增加種植體植入后的成功概率．

圖4 水滴在不同處理后鈦樣品表面的光學(xué)圖Fig.4 Optical images of water droplets on different treated Ti samples

2.4 生物活性

圖5為成骨細(xì)胞培養(yǎng)3 d后在不同處理樣品表面生長情況的SEM圖．圖5(a)和(b)為對照組,細(xì)胞呈多邊形,周圍存在大量偽足,但微絨毛很少．經(jīng)噴砂酸蝕處理后,如圖5(c)和(d),明顯可見噴砂酸蝕形成微米孔洞上附著大量的成骨細(xì)胞,細(xì)胞呈多邊形或梭形交錯相連,少數(shù)細(xì)胞能充填在大的微米孔內(nèi),細(xì)胞周圍存在大量的偽足吸附在表面或孔洞中,同時微絨毛相比對照組表面有較大程度的增加．SLA表面經(jīng)過陽極氧化處理后,如圖5(e)和(f)所示,同SLA表面的細(xì)胞形態(tài)基本相同,有大量的偽足存在,但相比之下,其偽足和微絨毛有進一步增加,說明相比之下其細(xì)胞黏附能力增強．對此表面進行相應(yīng)熱處理后,如圖5(g)和(h)所示,其表面微/納米形貌基本未發(fā)生改變,同時表面細(xì)胞的形態(tài)及偽足攀爬狀態(tài)和微絨毛的形成也未發(fā)生明顯的改變．

以上實驗說明,樣品表面的形貌及成分對成骨細(xì)胞的貼壁情況及黏附生長狀況均有較大的影響,一定程度上反映了不同處理表面的生物活性．相比于平整的鈦表面,多級微米形貌生長的成骨細(xì)胞能部分生長在微米孔內(nèi)或孔上,其偽足及微絨毛也能大量吸附在表面的微米結(jié)構(gòu)上,說明多級微米形貌在一定程度上有利于細(xì)胞的黏附和生長．隨后通過引入納米形貌,其微絨毛有更大程度的增加,說明構(gòu)筑的多級微/納米復(fù)合結(jié)構(gòu)相對于對照組具有更好的生物活性．

3 結(jié) 論

1) 采用180目Al2O3顆粒對純鈦基體進行噴砂和相應(yīng)酸蝕處理,獲得了10～20 μm不均勻的凹陷和5～8 μm微米級孔洞的表面形貌,構(gòu)成了初步的表面兩級微米結(jié)構(gòu),隨后在0.5%HF溶液中進行陽極氧化,在保留已有的兩級微米級形貌的同時,獲得直徑約為10 nm的無定形氧化鈦納米結(jié)構(gòu),經(jīng)400 ℃熱處理2 h后,無定形氧化鈦轉(zhuǎn)變?yōu)殇J鈦礦型,在鈦基體表面構(gòu)筑出多級微/納米活性表面結(jié)構(gòu),其親水性能由一般親水轉(zhuǎn)變?yōu)槌H水,從而達到增加種植體的作用面積、改善表面親水性的目的．

2) 細(xì)胞黏附實驗表明,細(xì)胞在樣品表面的黏附和親和力的優(yōu)劣程度依次為SLA-A-H>SLA-A>SLA>control,說明表面形貌、粗糙度、結(jié)晶度、親水性能均影響細(xì)胞的黏附和親和力,而構(gòu)筑的含銳鈦礦的多級微/納米復(fù)合結(jié)構(gòu)使得樣品比表面積有了較大程度的增加,增加了細(xì)胞與表面的接觸面積,從而更加有利于成骨細(xì)胞在其表面的生長,也利于后期植入材料與骨組織的骨性結(jié)合．

(a),(b)control;(c),(d)SLA;(e),(f)SLA-A;(g),(h)SLA-A-H.圖5 不同處理后的鈦樣品表面MG-63細(xì)胞培養(yǎng)3 d后的SEM圖Fig.5 SEM images of MG-63 cells on different treated Ti samples for 3 d

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