RRLC-Q-TOF-MS法研究人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為

李春梅，于 擎，孫 樂，吳 巍，郭迎迎，劉淑瑩,3

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117； 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)屬于五加科人參屬，是名貴中藥，其用藥已有兩千多年的歷史[1]。人參的主要有效成分是人參皂苷類化合物，具有廣泛的藥理活性[2-3]。紅參是人參藥材的常用炮制產(chǎn)品，研究表明，紅參中除含有與白參中一樣的人參皂苷外(人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1)，還含有人參皂苷Rh2和Rg3等稀有皂苷[4]。另外，由于人參皂苷存在一個20位手性碳原子，所以20位取代糖基在化學(xué)水解過程中，水分子可以從兩個方向同時進(jìn)攻20位碳原子，形成20-(R)人參皂苷Rh1、Rg3、Rg2等[5]。其中，人參皂苷Rh1是一種重要的稀有皂苷，主要作用于動物的神經(jīng)系統(tǒng)[6-8]，具有神經(jīng)保護(hù)、抗腦缺血、抗軟骨退變、抗腫瘤、抗過敏和抗炎活性等作用[9-10]，有望成為癡呆綜合癥、貧血、骨關(guān)節(jié)炎和白內(nèi)障的治療藥物。

在紅參提取物中，人參皂苷Rh1是由20-(S)和20-(R)型人參皂苷Rh1組成的混旋體[11]。人們對消旋體藥物非常重視，這是因為相對于非對映異構(gòu)體藥物，對映異構(gòu)體藥物在生物體內(nèi)會更多地受到酶等同樣帶有立體化學(xué)特征的生物大分子的影響，對映異構(gòu)體藥物之間的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)差異十分明顯[12]。Gui等[13]利用HPLC方法同時研究了20-(S)和20-(R)人參皂苷Rg2對映異構(gòu)體在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為；也有文獻(xiàn)報道了20-(S)-Rh1在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征及其苷元的檢測[14]；但目前尚未見關(guān)于20-(S)和20-(R)型人參皂苷Rh1混旋體的藥代動力學(xué)特征的報道。因此，同時分析檢測人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體及探索其藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特征對于人參的應(yīng)用是十分重要的。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成為分析人參皂苷代謝及藥代動力學(xué)特征的有效方法[15-20]。本工作采用高分離快速液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF-MS)技術(shù)，選擇適當(dāng)?shù)牧鲃酉?，通過高效快速分離，建立人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體的分離分析方法；并利用此方法對人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)進(jìn)行研究，比較20-(S)和20-(R)型人參皂苷Rh1在大鼠體內(nèi)的代謝差異。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent RRLC 1200 SL-6520 Q-TOF-MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：美國Agilent公司產(chǎn)品，其中RRLC 1200 SL配有在線脫氣機(jī)、二元梯度泵、可控溫自動進(jìn)樣系統(tǒng)和智能柱溫箱，Q-TOF-MS配有雙噴霧電離源；離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1及人參皂苷Rf(內(nèi)標(biāo))：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品，純度為98%，人參皂苷Rh1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖1；乙腈和甲醇(色譜純)：美國Tedia公司產(chǎn)品；丙二醇和聚乙二醇(分析純)：北京化工廠產(chǎn)品；甲酸銨：美國Sigma公司產(chǎn)品；水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得；其他試劑均為分析純。

圖1 20-(S)人參皂苷Rh1(a)和20-(R)人參皂苷Rh1(b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structures of 20-(S)-Rh1(a) and 20-(R)-Rh1(b)

1.2 實(shí)驗條件

1.2.1 色譜條件 Agilent SB C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)，柱溫30 ℃；流動相：A為水-乙腈(90∶10，V∶V)溶液，B為水-乙腈(10∶90，V∶V)溶液，均內(nèi)含15 mmol/L甲酸銨；二元線性梯度洗脫：0～15 min、24%B，15～16 min、24%～100% B，16～20 min、100%B；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧負(fù)離子模式，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速4 L/min，霧化氣壓力255 kPa，傳輸毛細(xì)管電壓3 500 V，碎裂器電壓200 V，錐孔電壓65 V。一級質(zhì)譜采樣頻率為2 s。實(shí)驗數(shù)據(jù)采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis(B. 03.01)軟件分析。

1.3 溶液配制及樣品處理

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 以甲醇為溶劑，將20-(S)人參皂苷Rh1、20-(R)人參皂苷Rh1和人參皂苷Rf(內(nèi)標(biāo))分別配制成195、39、40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液，于4 ℃冷藏備用，實(shí)驗時用甲醇稀釋。分別將100 μL 20-(S)、20-(R)人參皂苷Rh1標(biāo)準(zhǔn)溶液和100 μL內(nèi)標(biāo)儲備液加入到100 μL空白大鼠血漿中，混勻；再加入200 μL甲醇，渦旋1 min，以3 000 r/min離心5 min，取上清液，配制成濃度為39.00、3.90、1.95、0.98、0.49、0.24 mg/L的20-(S)人參皂苷Rh1和7.80、0.98、0.49、0.24、0.12、0.06、0.035 mg/L的20-(R)人參皂苷Rh1的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備 將20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1溶于生理鹽水中，給藥量為25 mg/kg，對應(yīng)于20-(S)人參皂苷Rh1為23 mg/kg，20-(R)人參皂苷Rh1為2 mg/kg。

1.3.3 動物實(shí)驗 選取6只Wister大鼠(體重(200 ± 10) g，雄性，購自吉林大學(xué))，實(shí)驗前12 h禁食不禁水。分別注射23 mg/kg和2 mg/kg 20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1混合樣品，在注射后1、3、5、10、20、30、40、60 min的時間點(diǎn)通過目內(nèi)眥取血，每個時間點(diǎn)取0.5 mL血。血樣自然冷卻后，以3 000 r/min離心5 min。取100 μL血漿，加入100 μL內(nèi)標(biāo)儲備液和300 μL甲醇，離心后取上清液，裝入樣品瓶中，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

由于對映異構(gòu)體的極性相近，所以一般情況下不能用常規(guī)的液相色譜柱進(jìn)行分離。為了獲得人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體的基線分離，本工作使用常規(guī)的Agilent SB C18色譜柱，以甲酸銨作為流動相添加劑，同時添加到水相和有機(jī)相中，成功地分離了人參皂苷Rh1的對映異構(gòu)體。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，甲酸銨濃度對分離有著較大的影響，隨著甲酸銨濃度的增加，流動相的pH值下降，同時20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1的分離度不斷上升。結(jié)果表明，甲酸銨濃度為15 mmol/L時，人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體獲得了基線分離，達(dá)到了很好的分離度，20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1分離的保留時間分別為9.49 min和10.72 min。

20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1在質(zhì)譜的正離子模式和負(fù)離子模式下均可檢測到，其質(zhì)譜圖示于圖2。由圖2a可見，在正離子模式下，一級質(zhì)譜圖中生成的人參皂苷碎片離子種類較多，包括[M+H-Glc-2H2O]+、[M+H-H2O]+和[M+H-2H2O]+，其中[M+H-Glc-2H2O]+是最穩(wěn)定且豐度最高的離子，通過調(diào)節(jié)質(zhì)譜碎裂電壓不但不能減弱脫水反應(yīng)，反而會降低儀器的靈敏度。由圖2b可見，在負(fù)離子模式下，人參皂苷Rh1產(chǎn)生離子的類型比較簡單，在一級質(zhì)譜圖中，產(chǎn)生[M-H]-和[M+HCOO]-離子，其中 [M+HCOO]-離子是基峰，其豐度遠(yuǎn)高于[M-H]-離子，所以本工作采用負(fù)離子模式進(jìn)行分析。

2.2 方法學(xué)確證

2.2.1 選擇性 空白血漿和使用標(biāo)準(zhǔn)加入法加入了20-(R,S)人參皂苷Rh1混旋體和內(nèi)標(biāo)的血漿樣品的總離子流圖示于圖3。由圖3可見，人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體獲得了基線分離，且在2個色譜峰之間沒有任何基質(zhì)干擾峰存在，表明此方法具有良好的選擇性。

圖2 人參皂苷Rh1在正離子模式下(a)和負(fù)離子模式下(b)的一級質(zhì)譜圖Fig.2 The full-scan mass spectrum of ginsenoside Rh1 in positive ion mode(a) and in negative ion mode(b)

圖3 空白血漿(a)，加入20-(R, S)人參皂苷Rh1和內(nèi)標(biāo)(b)的總離子流圖Fig.3 The total ion chromatogram of blank plasma(a), the plasma added 20-(R, S)ginsenoside Rh1 and internal standard(b)

2.2.2 線性關(guān)系考察 以血漿中20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1的濃度為橫坐標(biāo)，20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1與人參皂苷Rf(內(nèi)標(biāo))的面積比為縱坐標(biāo)，通過最小二乘線性回歸法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，列于表1。結(jié)果表明，20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1具有良好的線性關(guān)系，定量限分別為0.20 mg/L和0.03 mg/L。

2.2.3 精確度與精密度 按1.3.1方法制備高、中、低3個濃度的質(zhì)量控制樣品，每個濃度制備5個樣本，連續(xù)測定3天。20-(S)人參皂苷Rh1濃度為39.00、1.95和0.24 mg/L；20-(R)人參皂苷Rh1濃度為7.80、0.49和0.035 mg/L。質(zhì)量控制樣品的日內(nèi)和日間精密度列于表2。兩者的日內(nèi)精密度分別為89.54%～95.79% 和88.76%～94.33%；日間精密度分別為88.16%～92.41%和88.49%～94.35%；RSD值均小于5%。結(jié)果表明，該方法具有較好的精確度與精密度。

2.2.4 提取回收率 分別取高、中、低3個濃度20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1的質(zhì)量控制樣品，加入到空白血漿中，經(jīng)沉淀蛋白等處理后，測其峰面積。以此峰面積與空白血漿處理后加入相同量的20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1所測得的峰面積比值來考察樣品的提取回收率。結(jié)果表明，提取回收率的范圍可以滿足20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1的測定要求，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，結(jié)果列于表3。

2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗 考察了高、中、低3個濃度的質(zhì)量控制樣本的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，待測物連續(xù)3天在3個冷凍(-20 ℃)—解凍循環(huán)(室溫)中穩(wěn)定，提取后的樣品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

表1 大鼠血漿中20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)和線性范圍

表2 質(zhì)量控制樣品的日內(nèi)和日間精密度(n=5)

表3 大鼠血漿中20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1的提取回收率(n=3)

2.3 方法學(xué)應(yīng)用

利用所建立的方法研究大鼠血漿中的20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1的藥代動力學(xué)行為。靜脈注射后，6只大鼠的平均血液藥物濃度-時間曲線示于圖4。通過赤池信息標(biāo)準(zhǔn)(AIC)進(jìn)行房室模型分析表明，20-(S)人參皂苷Rh1圖形符合二室模型特征，而20-(R)人參皂苷Rh1符合一室模型特征。20-(S)人參皂苷Rh1血藥濃度半衰期的α相(t1/2α)和β相(t1/2β)分別為1.74±0.064和15.19±0.65，而20-(R)人參皂苷Rh1血藥濃度半衰期為6.10±0.16，其主要藥代動力學(xué)參數(shù)列于表4。實(shí)驗結(jié)果表明，人參皂苷對映異構(gòu)體之間的代謝差異較大，20-(S)人參皂苷Rh1的清除速率大于20-(R)人參皂苷Rh1，這為臨床應(yīng)用20-(R，S)人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體提供了理論依據(jù)。

圖4 尾靜脈注射20-(S)-Rh1和20-(R)-Rh1后，6只大鼠的平均血液藥物濃度-時間曲線(n=6)Fig.4 The average blood drug concentration-time curve of 6 rats after intravenous injection of 20-(S)-Rh1 and 20-(R)-Rh1(n=6)

化合物名稱參數(shù)單位測定值C0mg/L39.53±0.30t1/2αmin1.74±0.064t1/2βmin15.19±0.65Ke1/h0.24±0.01120-(S)人參皂苷Rh1k121/h0.13±0.022k211/h0.076±0.003 3AUC(mg·min)/L164.75±12.55VcmL0.58±0.042CLmL/h0.11±0.009 8t1/2min6.10±0.16AUC(mg·min)/L37.46±2.2120-(R)人參皂苷Rh1C0mg/L4.25±0.098Ke1/h0.11±0.005 3VdmL0.47±0.004 4CLmL/h0.053±0.002 8

3 結(jié)論

本工作建立了一種快速、簡單且重復(fù)性好的，使用常規(guī)Agilent SB C18色譜柱同時定性定量分析20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1對映異構(gòu)體的RRLC-Q-TOF-MS方法。流動相的改進(jìn)是此方法的關(guān)鍵，15 mmol/L甲酸銨在有效提高柱效和分離度的同時，流動相的pH值也不超出色譜柱的承受范圍。質(zhì)譜檢測采用負(fù)離子模式進(jìn)行分析，20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1的定量范圍分別為39.00～0.24 mg/L和7.80～0.035 mg/L。2個對映異構(gòu)體的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性均能滿足藥代動力學(xué)研究的要求。該方法能夠同時測定在尾靜脈注射20-(S)和20-(R)人參皂苷Rh1后血漿中的濃度，從而進(jìn)行藥代動力學(xué)研究，可為今后20-(R,S)人參皂苷Rh1的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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