氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定乳制品中三聚氰胺及其3種類似物

林曉珊，吳惠勤，黃曉蘭，馬葉芬，朱志鑫，黃 芳，羅輝泰，鄧 欣

(中國廣州分析測試中心，廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東 廣州 510070)

三聚氰胺(melamine，CAS號：108-78-1)是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，是重要的氮雜環(huán)有機化工原料，常用于制造三聚氰胺樹脂。在三聚氰胺制造過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)可能會形成三聚氰酸(cyanuric acid)、三聚氰酸一酰胺(ammeline)和三聚氰酸二酰胺(ammelide)等類似物，一些不法分子利用其含氮量高，將其添加到乳制品中以提高氮含量。2007年爆發(fā)的貓和狗等寵物食品事件，2008年爆發(fā)的三鹿奶粉事件都是因違法添加三聚氰胺導致的。目前，三聚氰胺已嚴禁直接用于食品。三聚氰胺和三聚氰酸雖然只有低急性毒性，但有證據(jù)顯示，在同時攝入三聚氰胺和三聚氰酸后會導致腎毒性。研究人員試驗了大鼠單獨攝入三聚氰胺或其類似物的1種、三聚氰胺和三聚氰酸的混合物，以及4種化合物的混合物，發(fā)現(xiàn)單獨攝入均未對腎產(chǎn)生任何副作用，但攝入混合物則產(chǎn)生明顯的腎損傷[1]。因此，在乳制品中同時檢測三聚氰胺及其3種類似物非常重要。

目前，對三聚氰胺及其同系物檢測方法的報道主要針對生鮮乳、豬組織、食品以及食品添加劑等樣品，多采用液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等[2-16]，但都存在一定的缺陷。如王煉等[15]利用超高效液相色譜法測定乳及乳制品中三聚氰胺，該方法只針對三聚氰胺一種成分，且只用保留時間定性。朱聰英等[16]利用GC/MS法同時測定生鮮乳中三聚氰胺及其類似物，4種化合物的檢出限為0.1～0.2 mg/kg，且所采用的選擇離子(SIM)法僅適合基體簡單的生鮮乳，而對于基質(zhì)較復雜的乳制品，則干擾較大，會造成靈敏度不夠，影響結(jié)果的準確性。

由于三聚氰胺及其3種類似物中包含了酸性和堿性化合物，較難用單一的固相萃取小柱凈化，而且乳制品基質(zhì)成分較復雜，給色譜分離和硅烷化處理帶來了困難，即使采用選擇離子檢測法也難以消除，影響了測定的準確度，易產(chǎn)生假陽性。本研究采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)技術，通過“母離子>子離子”的多反應監(jiān)測模式(MRM)，快速測定乳制品中的三聚氰胺及其3種類似物。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7000A三重四極桿氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；氮吹儀：上海安譜科學儀器有限公司產(chǎn)品；TDL-80-2B低速臺式離心機：上海飛鴿牌產(chǎn)品。

三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺：德國CNW Technologies GmbH公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：德國Merck公司產(chǎn)品；二乙胺、三氯乙酸、乙酸鋅、吡啶(分析純)：廣州化學試劑廠產(chǎn)品；硅烷化試劑(含有1%三甲基一氯硅烷(TMCS)的N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA))：上海安譜科學儀器有限公司產(chǎn)品；實驗用水為蒸餾水；乳制品(奶粉、液態(tài)奶、酸牛奶、含乳飲料、奶茶、煉乳、奶酪)：均購自超市。

1.2 標準工作溶液的制備

準確稱取10.0 mg(精確至0.1 mg)標準物質(zhì)，用V(二乙胺)∶V(水)=20∶80的溶液超聲溶解，并定容至100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.1 g/L混合標準儲備溶液，在-18 ℃以下冷凍，避光保存，有效期3個月。實驗需要時，準確移取一定體積的混合標準儲備溶液，用V(二乙胺)∶V(水)∶V(乙腈)= 10∶40∶50的溶液稀釋成0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/L系列濃度混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 稱取0.5 g(精確至0.001 g) 試樣于50 mL具塞離心管中,加入20 mL提取溶劑，渦旋1 min，超聲提取30 min，然后以4 000 r/min離心5 min，取200 μL上層清液于10 mL尖底具塞玻璃比色管中，70 ℃下經(jīng)氮氣吹干。

1.3.2 衍生化 向吹干后的比色管中加入300 μL吡啶和200 μL硅烷化試劑，超聲振蕩1 min，渦旋1 min后，于70 ℃衍生45 min，衍生化的溶液進行GC-MS/MS分析。混合標準工作溶液按上述步驟同時進行衍生。

1.4 GC-MS/MS分析

1.4.1 色譜條件 色譜柱： HP-1MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：He(99.999%)；碰撞氣為 N2；柱流量0.9 mL/min，恒流；不分流進樣；進樣量1.0 μL；進樣口溫度280 ℃；升溫程序：柱初始溫度70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min至280 ℃，保持8 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 EI離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，色譜-質(zhì)譜連接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1 500 V，溶劑延遲時間6 min，MRM掃描模式。選擇母離子、子離子、碰撞能量及保留時間列于表1。

表1 母離子、子離子、碰撞能量及保留時間

注：*定量離子對

1.4.3 測定方法 各取1.0 μL樣品溶液和標準溶液注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析，得到GC-MS/MS的MRM圖。以保留時間和二級質(zhì)譜特征碎片離子定性，以定量離子對的峰面積外標法計算樣品中三聚氰胺及其3種類似物的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

2.1.1 提取方法的選擇 現(xiàn)有的檢測方法只針對三聚氰胺一種物質(zhì)，一般采用陰離子固相萃取小柱凈化，前處理步驟較為繁瑣。而乳制品中三聚氰胺及其3種類似物的基質(zhì)較復雜，對提取溶劑要求較高，本研究進行了3種方法的比較。1)用水稀釋或溶解樣品，以V(1%三氯乙酸)∶V(乙腈)=75∶25的溶液超聲提取，沉淀蛋白效果好，加標回收率在72%左右；2)用水稀釋或溶解樣品，以22 g/LV(乙酸鋅)∶V(乙腈)=75∶25的溶液超聲提取，沉淀蛋白效果好，加標回收率在68%左右；3)用V(二乙胺)∶V(水)∶V(乙腈)=10∶40∶50 的溶液超聲提取，破壞了三聚氰胺及其3種類似物可能同時存在的離子對，提高了目標物的溶解度，加標回收率大于92.5%。本研究選擇方法(3)作為提取溶劑。

2.1.2 提取溶劑用量及衍生條件的選擇 由于樣品基質(zhì)較復雜，本研究考察了樣品量、提取溶劑用量及衍生條件對定量結(jié)果的影響。稱取2組空白樣品進行加標回收實驗，稱樣量為0.5、1.0 g，分別加入5、10、15、20、25、30 mL提取液，對比吸取100、200、300、400、500 μL上清液，進行氮吹濃縮和硅烷化衍生，比較結(jié)果列于表2。

結(jié)果表明：1)稱樣量增大時，本底干擾大，基質(zhì)復雜，回收率降低；2)隨著提取溶劑的增多，回收率有所增加，用20 mL提取溶劑基本能夠提取完全，且提取溶劑較為澄清；3)取提取溶劑氮吹濃縮時，溶劑量越大，本底干擾越大，濃縮越難，對硅烷化衍生影響較大，使回收率降低。綜上，本實驗選擇取樣量為0.5 g，提取溶劑為20 mL，離心后，吸取200 μL上清液進行氮吹濃縮和硅烷化衍生。

2.2 色譜條件的選擇

目標化合物進行硅烷化衍生后極性較弱，采用AB-5MS弱極性柱，通過改變起始溫度、程序升溫速率和柱流量等參數(shù)，篩選出最佳的色譜條件，使目標化合物的峰形好、出峰快、流失小，三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺能完全達到基線分離。

表2 前處理條件比較結(jié)果

2.3 GC-MS/MS質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過全掃描確定三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺衍生物的質(zhì)譜圖，三聚氰胺以m/z342和m/z327作為母離子，三聚氰酸以m/z345和m/z330作為母離子，三聚氰酸一酰胺以m/z344和m/z329作為母離子，三聚氰酸二酰胺以m/z343和m/z328作為母離子，進行子離子掃描，其特征離子圖示于圖1。通過對碰撞能量5、10、15、20、25、30、35、40、45 V進行優(yōu)化，三聚氰胺及其3種類似物優(yōu)化后的MRM參數(shù)已在表1中列出。采用 MRM模式，消除了乳制品中復雜基質(zhì)的干擾，提高了檢測的靈敏度及準確度。

注：a．三聚氰胺；b．三聚氰酸；c．三聚氰酸一酰胺；d．三聚氰酸二酰胺 圖1 三聚氰胺及其3種類似物的特征離子圖 Fig.1 Characteristic ion chromatogram of melamine and its three analogues

2.4 基質(zhì)效應

分別取各種乳制品樣品(奶粉、液態(tài)奶、酸牛奶、含乳飲料、奶茶、煉乳、奶酪)，按1.3.1方法進行提取后，用此提取液配制標準溶液，按1.3.2方法進行衍生化處理，GC-MS/MS進樣分析，以其色譜峰峰面積與相應濃度標準溶液(純?nèi)軇┡渲?的色譜峰峰面積的比值為基質(zhì)效應。結(jié)果表明，基質(zhì)效應影響不大，可忽略。

2.5 方法學驗證

2.5.1 檢出限及定量限 在空白奶粉樣品中添加一定濃度的標準溶液，測定檢出限及定量限。按3倍信噪比計算，三聚氰胺及其3種類似物的檢出限均達到0.05 mg/kg；按10倍信噪比計算，定量限均達到0.1 mg/kg，能滿足乳制品中三聚氰胺及其3種類似物的限量要求。

2.5.2 標準曲線及線性范圍 配制0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/L三聚氰胺及其3種類似物的混合標準系列溶液，衍生化后進行測定，以峰面積y為縱坐標，質(zhì)量濃度x(mg/L)為橫坐標，繪制標準工作曲線。三聚氰胺及其3種類似物的混合標準溶液的GC-MS/MS圖示于圖2。在0.01～1.0 mg/L范圍內(nèi)，三聚氰胺及其3種類似物的線性關系均良好，線性回歸方程及相關系數(shù)列于表3。

2.5.3 回收率及精密度 在空白奶粉樣品中加入混合標準工作溶液，使樣品加標水平分別為0.5、1.0、2.0 mg/kg，每個加標水平進行6次平行測定，按1.3處理樣品后，同時測定三聚氰胺及其3種類似物的含量，計算回收率和精密度。3個添加水平的回收率為92.5%～102.5%，相對標準偏差(RSD)為2.5%～5.0%，結(jié)果列于表4。該方法的準確度和精密度均較高，且具有較好的可靠性和重現(xiàn)性。

注：a．三聚氰胺；b．三聚氰酸；c．三聚氰酸一酰胺；d．三聚氰酸二酰胺圖2 三聚氰胺及其3種類似物的GC-MS/MS圖Fig.2 Chromatogram of melamine and its three analogues by GC-MS/MS

2.6 實際樣品的測定

采用本研究建立的GC-MS/MS方法對購自超市的乳制品(奶粉、液態(tài)奶、酸牛奶、含乳飲料、奶茶、煉乳、奶酪)進行分析，結(jié)果表明，在1種奶粉和1種液態(tài)奶中檢出三聚氰胺，含量分別為0.89 mg/kg和1.75 mg/kg，未超過國家限量標準2.5 mg/kg；在所有樣品中均未檢出三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺，基質(zhì)標樣(0.1 mg/L)的質(zhì)譜圖示于圖3。

表3 三聚氰胺及其3種類似物的
線性方程和相關系數(shù)
Table 3 The linear equations and correlation
coefficients of melamine and its three analogues

組分名稱線性方程相關系數(shù)三聚氰胺y=2 936 173x-23 8210.999 8三聚氰酸y=2 898 483x+114 3500.998 2三聚氰酸一酰胺y=4 239 414x-33 9180.999 9三聚氰酸二酰胺y=6 167 243x-64 4530.999 8

注：a．三聚氰胺；b．三聚氰酸；c．三聚氰酸一酰胺；d．三聚氰酸二酰胺圖3 基質(zhì)標樣的GC-MS/MS圖 Fig.3 GC-MS/MS multiple-reaction monitoring(MRM) chromatography of the matrix samples

組分名稱加入量/(mg/kg)實測值/(mg/kg)回收率/%相對標準偏差/%0.50.44,0.45,0.47,0.48,0.49,0.4893.64.14三聚氰胺1.00.92,0.93,0.89,0.95,0.96,0.9092.52.962.01.85,1.92,1.95,1.98,1.93,1.8695.82.660.50.43,0.48,0.46,0.44,0.47,0.4892.64.02三聚氰酸1.00.95,0.91,0.97,0.92,0.96,0.9394.02.522.02.09,2.11,2.10,1.98,1.97,2.07102.53.030.50.47,0.48,0.45,0.47,0.44,0.4792.73.25三聚氰酸一酰胺1.00.95,0.94,0.86,0.97,0.98,0.9293.74.612.01.93,1.87,1.97,1.92,1.96,1.8595.82.500.50.48,0.44,0.50,0.47,0.44,0.4793.35.00三聚氰酸二酰胺1.00.92,0.93,0.95,0.97,0.96,0.9095.32.722.01.95,1.98,1.99,2.02,1.94,1.8797.92.65

3 結(jié)論

通過對樣品前處理條件和質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，采用V(二乙胺)∶V(水)∶V(乙腈)=10∶40∶50的溶液提取樣品中待測物，提取液經(jīng)氮吹儀濃縮后，用硅烷化試劑衍生，GC-MS/MS法測定。結(jié)果表明：該方法簡便、快速，無需小柱，具有保留時間和串聯(lián)質(zhì)譜特征離子對確證的優(yōu)點；并且準確可靠，靈敏度高，節(jié)省了樣品的前處理時間及成本。方法的選擇性好、信噪比高，檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg，能滿足同時測定三聚氰胺及其3種類似物的要求。

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