DGAT和PDAT基因在油菜籽油分積累中的作用

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(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所/國(guó)家油料改良中心湖南分中心，長(zhǎng)沙 410128)

油菜是世界上第三大油料作物，中國(guó)第一大油料作物。中國(guó)的油菜種植面積和總產(chǎn)均位居世界第一，年種植面積近1.1億畝，總產(chǎn)達(dá)1 200多萬噸。油菜“雙低化”以來，隨著育種技術(shù)的發(fā)展，優(yōu)質(zhì)油菜品種不斷涌現(xiàn)，菜油品質(zhì)也相應(yīng)提高，其中較好的菜油飽和脂肪酸含量7%左右，在所有植物油中含量最低，因而被稱為“東方橄欖油”。

我國(guó)食用植物油的自給率很低，不到40%，長(zhǎng)期依賴大量進(jìn)口[1]。在耕地減少、擴(kuò)大種植面積困難的情況下，2012年農(nóng)業(yè)部把提高油菜籽含油量列為油菜育種的主要目標(biāo)加以研究，以圖緩解我國(guó)食用植物油供求矛盾。油菜籽含油量對(duì)于保障菜油供應(yīng)具有十分重要的意義，含油量提高1%，相當(dāng)于增產(chǎn)2.3%～2.5%[2]。但提高含油量育種一度被忽視，在過去的20年中油菜籽平均含油量?jī)H提高了2～3個(gè)百分點(diǎn)[3,4]。長(zhǎng)江流域是我國(guó)油菜主產(chǎn)區(qū)，油菜籽含油量為41%～42%，比加拿大低4～6個(gè)百分點(diǎn)[5]，成為制約我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。

油菜籽油分的形成積累是一系列基因調(diào)控的結(jié)果。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)和新發(fā)現(xiàn)的磷脂:二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(PDAT)的編碼基因是催化甘油二酯合成甘油三酯的2個(gè)關(guān)鍵酶，通過從不同含油量品種中克隆這些基因的全部拷貝，研究各個(gè)拷貝在種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)和活性，揭示油菜含油量不同的品種中DGAT和PDAT基因的遺傳多樣性，研究其表達(dá)量、酶活性與含油量的關(guān)系，可為選育高含油量油菜品種提供理論依據(jù)和基因資源。

1 三酰甘油合成途徑

常見的三酰甘油(TAG)合成在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行。在該合成途徑中，甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)3個(gè)?；D(zhuǎn)移酶依次將酰基CoA的脂肪酸轉(zhuǎn)移到甘油，被稱為依賴?；鵆oA的Kennedy途徑[7]。

近年來發(fā)現(xiàn)了另一合成途徑，區(qū)別在于利用磷脂作為?；w，二酰甘油(DAG)作為受體，磷脂:二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)sn-2位的?；D(zhuǎn)移到DAG上，形成TAG和溶血磷脂酰膽堿[8](圖1) 。

2 合成途徑對(duì)三酰甘油脂肪酸組成的影響

甘油骨架上3個(gè)脂肪酸的種類和特性決定三酰甘油的性質(zhì)。油中TAGs脂肪酸的立體化學(xué)分析顯示，飽和脂肪酸通常位于甘油分子的sn-l和sn-3位置，不飽和脂肪酸則大多發(fā)生在sn-2位置。調(diào)控DGAT1和PDAT1途徑能影響sn-3位置的脂肪酸組成。通過DGAT1途徑形成的三酰甘油?；w為酰基輔酶A。由于新合成的?；o酶A中不存在多不飽和脂肪酸，因此，通過?；o酶A為供體合成三酰甘油的途徑形成的三酰甘油，sn-3位置的多不飽和脂肪酸含量低。而PDAT1以磷脂為酰基供體合成的三酰甘油，磷脂(如磷脂酰膽堿)是脂肪酸脫氫酶(如FAD2和FAD3)的作用底物，在磷脂上的?；洳伙柡托愿撸虼?，通過該代謝途徑形成三酰甘油的多不飽和性更高。在擬南芥dgat1-1突變體種子中，亞麻酸含量由野生型的18%提高到約40%。其中，亞麻酸在sn-3位置上的相對(duì)含量也由野生型的12%提高到39%[9]。在dgatl-2突變體中，亞麻酸含量也大幅度提高[10]。

3 DGAT和PDAT基因的功能研究進(jìn)展

DGAT有DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和可溶性的DGAT四類。DGAT1編碼一種定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白，在不同物種中該基因的生化特性存在差異。DGAT是Kennedy途徑中的限速酶。在高油及低油大豆品種中研究發(fā)現(xiàn)，DGAT1基因表達(dá)的活性與大豆含油量、油脂積累速率呈正比[11]。DGAT1基因首先是Hobbs從擬南芥中克隆得到的，隨之，在大豆[12]、向日葵等油料作物中也成功克隆到了DGAT1基因。DGAT1和DGAT2在不同植物及同一植物的不同發(fā)育階段起不同的作用，甚至于產(chǎn)生不同脂肪酸組分的TAG[13]。Kroon JT等研究發(fā)現(xiàn)，在油桐樹的種子中，DGAT2的表達(dá)水平及在油脂合成中的作用均高于DGAT1，且對(duì)桐油酸有強(qiáng)烈的底物選擇性[14]。Shockey JM等在蓖麻種子中也發(fā)現(xiàn)，DGAT2表達(dá)水平更高、在油脂合成中作用更大[15]。

DGAT基因過量表達(dá)可明顯提高植物的含油量及種子的大小[16,17]。在野生型擬南芥種子中過量表達(dá)DGAT基因可以提高種子的含油量和重量[18]。在玉米[19]、擬南芥和油菜[20]和野生型擬南芥、高芥酸油菜和低芥酸油菜中[21]都能顯著提高種子的含油量。超量表達(dá)DGAT基因能夠提高作物種子的含油量，DGAT基因是否與油菜含油量有關(guān)或者說哪個(gè)基因有關(guān)等問題很值得研究。PDAT1合成途徑直到2009年才在擬南芥中被闡明[19]。擬南芥DGAT1-1基因突變體，盡管缺乏DGAT1功能，含油量只比野生型降低30%，表明在DGAT1基因缺失的情況下，PDAT1是正常種子發(fā)育必不可少的，是擬南芥TAG生物合成的一個(gè)主要決定因素。但在dgat1背景下干擾PDAT1表達(dá)，或在相反情況下，擬南芥種子含油量均減少70%～80%，且胚發(fā)育受阻。pdat1/dgat1雙突變純合體，出現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象[22]。進(jìn)一步研究表明，DGAT1-1基因突變體主要是LPCAT2上調(diào)增大了DAG池庫容，保持了PC的供應(yīng)，造成PDAT1催化的TAG合成增加[23]。擬南芥DGAT1或PDAT1過表達(dá)的種子TAG含量與野生型相比無明顯變化[24,25]。以上研究均表明二者可能在功能上交疊。

4 油菜DGAT和PDAT基因研究進(jìn)展

油菜三酰甘油的兩條合成代謝途徑的研究較為緩慢。Nykiforuk等(2002)最早在油菜懸浮細(xì)胞中克隆獲得兩條DGAT的cDNA序列，其中BnDGAT1在懸浮細(xì)胞中表達(dá)水平的升高能夠提高TAG的合成量，BnDGAT2缺失了BnDGAT1中所含有的N端親水結(jié)構(gòu)域，可能為懸浮系所特有[26]。Weselake等發(fā)現(xiàn)BnDGAT1通過N端結(jié)構(gòu)域接受?；?CoA的調(diào)控[27]。Lock等沉默油菜中的DGAT1基因，導(dǎo)致種子的含油量降低，脂肪酸組成改變，以及一系列種子發(fā)育異常，說明DGAT1在油菜的油脂合成代謝中扮演重要角色[28]。Siloto等[29]通過對(duì)油菜BnDGATl基因易錯(cuò)PCR進(jìn)行突變，得到了BnDGATl基因的突變庫，將突變體庫轉(zhuǎn)入酵母中，發(fā)現(xiàn)一些活性提高的DGAT突變體。但不同油菜品種中DGAT基因的拷貝數(shù)、遺傳多態(tài)性、表達(dá)量等與含油量的關(guān)系尚不清楚。在油菜中是否存在PDAT1合成途徑、有多少個(gè)PDAT1基因、遺傳變異如何等等問題尚未研究，DGAT1和PDAT1兩條途徑對(duì)TAG合成積累的貢獻(xiàn)大小、相互關(guān)系則更是未知。

植物油脂代謝是一個(gè)由多基因參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程。擬南芥基因組中600多個(gè)基因形成了油脂代謝網(wǎng)絡(luò)[6]。我國(guó)主要種植的甘藍(lán)型油菜是異源四倍體，油菜籽油分形成積累可能更為復(fù)雜。在這個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中，選擇由甘油二酯最終合成甘油三酯步驟的2個(gè)酶即二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因(DGAT)和磷脂:二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因(PDAT)的編碼基因進(jìn)行克隆、表達(dá)分析和活性測(cè)定，探討這2個(gè)基因在油菜中的遺傳多態(tài)性、表達(dá)與含油量的關(guān)系，可以為選育高含油量油菜品種提供理論依據(jù)和基因資源。

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