TLC-SERS聯(lián)用法檢測降糖中成藥中添加的格列類藥品

秦劍紅 (解放軍169醫(yī)院藥械科，湖南 衡陽 421001)

一直以來，中藥制劑摻假現(xiàn)象屢禁不止，其種類繁多，作用機制不明，且相應的檢測質量標準尚不完善，使得不法分子有機可乘。對于中藥摻雜化學成分的檢測，常用方法有薄層色譜法(TLC)[1,2]、高效液相色譜法(HPLC)[3,4]、液質聯(lián)用法(LC-MS)[5,6]等。傳統(tǒng)的TLC法操作簡單，但存在較高的假陽性；HPLC、LC-MS法靈敏度高且準確性好，但其樣品前處理過程復雜，且需要特定規(guī)格的試劑和色譜柱，檢測成本較高，不易于基層推廣。隨著便攜式拉曼光譜儀的普及，表面增強拉曼光譜技術逐漸在分析檢測領域得到較多應用[7,8]。表面增強拉曼散射光譜(surfcae enhanced Raman scattering，SERS)能夠提供分子能級的指紋圖譜，且信號強度好，通常為常規(guī)拉曼光譜的104～106倍。將其與TLC方法相結合，先對復雜樣品進行初步分離，然后采用SERS技術檢測，獲得待測物的特征指紋圖譜，從而進行更準確的定性判別。目前，SERS技術已用于水污染的現(xiàn)場監(jiān)控[9]、中藥成分非法添加西藥成分的檢測[10]、生物尿樣中可卡因代謝產(chǎn)物的定量分析[11]、中草藥中結構相似生物堿成分的鑒別[12]等。

本研究采用TLC與SERS聯(lián)用方法對降糖中成藥中添加的格列類藥物(格列喹酮、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特)進行檢測，首次采用有機相銀溶膠獲得了5種格列類化學降糖藥的SERS圖譜，可用于中藥中非法添加該類化學藥成分的快速檢測。

1 材料與儀器

1.1 材料 格列齊特(批號：100296-201004)、格列本脲(批號：100135-200404)、格列美脲(批號：100674-201102)、格列吡嗪(批號：100281-200602)、格列喹酮(批號：100280-201002)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；硝酸銀、檸檬酸三鈉、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；薄層板HSGF254(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；實驗用水為二次蒸餾水；實驗中所用的降糖中藥陰性樣品(不含非法添加成分)由山東省食品藥品檢驗所提供。

1.2 儀器 BWS415-785H型便攜式拉曼光譜儀(必達泰克)，配有BAC151視頻顯微拉曼檢測系統(tǒng)，激發(fā)光源785 nm，分辨率3.5 cm-1@912 nm，光譜范圍175～2 700 cm-1；TG16-WS型高速離心機(上海盧湘儀)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；WFH-203B型紫外分析儀(精科實業(yè))；普析通用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計。

2 方法

2.1 銀膠溶液的配制 將10 ml AgNO3與PVP(摩爾比10:1)的混合溶液加入100 ml沸騰的DMF中，其中AgNO31×10-3mol/L，繼續(xù)加熱1 min，見溶液由無色變?yōu)辄S綠色，最終變?yōu)辄S棕色的銀膠溶液，冷卻備用。

2.2 樣品溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 稱取格列本脲、格列齊特、格列美脲、格列喹酮、格列吡嗪對照品適量，加甲醇-氯仿(1:1)溶解，分別制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液備用。

2.2.2 模擬陽性樣品溶液 取降糖類中藥陰性樣品(不含非法添加成分)適量，研細，另精密稱取適量降糖藥對照品加入其中，使各個成分添加量均為1%(W/W)，加甲醇-氯仿(1:1)溶解，超聲10 min，離心后取上清液，作為降糖藥的模擬陽性樣品溶液。

2.2.3 真實樣品溶液 取降糖類中成藥樣品各1.5 mg，研細，加甲醇1 ml溶解，超聲15 min，以10 000 r/min離心5 min后取上清液，作為真實樣品溶液備用。

2.3 檢測方法 吸取對照品溶液和模擬陽性樣品溶液各1 μl，點于同一硅膠板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(9:5:1)展開后取出，晾干，置于紫外燈(254 nm)下檢視定位，于陽性樣品色譜條帶中與對照品Rf值相同位置處，滴加納米銀溶膠5 μl，對滴加銀膠的位置進行檢測，放大20倍，積分時間20 s，激光功率100 mW，將所得圖譜與對照品的SERS譜進行對比分析，得出結果。

2.4 數(shù)據(jù)預處理方法 采用軟件Matlab 7.6對所得光譜進行譜段選取( 300～1 700 cm-1)、Savitzky-Golay(Sgolay)法平滑、adaptive iteratively reweighted Penalized Least Squares(airPLS)法基線校正和歸一化等預處理；制圖軟件使用Origin 7.5。

3 結果與討論

3.1 薄層色譜條件的優(yōu)選 參照國家藥品標準[13]和相關文獻方法[2，14]，對薄層色譜展開條件進行比較。實驗中考察了(a)氯仿-環(huán)己烷-乙醇-冰醋酸(8:13:1:1)；(b)環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(14:6:1:0.1)；(c)環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(5:5:1)的展開情況。結果(a)、(b)體系下，分離效果均不理想，選擇較簡單的(c)體系進行調節(jié)，三者比例為9:5:1時效果較佳，格列喹酮、格列齊特、格列美脲、格列本脲、格列吡嗪的Rf值分別為0.72、0.66、0.56、0.47、0.35。

3.2 不同銀溶膠的檢測結果

3.2.1 銀溶膠的選擇與制備 采用傳統(tǒng)的檸檬酸鈉還原法制備所得銀溶膠[15,16]進行實驗時，增強效果均較差，幾乎無增強信號；嘗試使用氯化鈉、硝酸鉀等凝聚劑，并換用不同濃度的銀溶膠，效果仍不理想?？赡苡捎跈z測物均為水不溶性，難以與水溶性的納米銀粒子結合形成SERS“熱點”，故無法產(chǎn)生較好的增強效應。因此，對于這種疏水性物質， 考慮采用有機溶劑制備的有機相的銀溶膠進行檢測。在制備有機相納米銀溶膠時，參照文獻[17]、[18]，嘗試采用甲醇、乙腈、聚乙二醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃等溶劑制備納米銀溶膠，最終選擇以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑制備納米銀顆粒。DMF在整個反應過程中作為溶劑與還原劑，此外，為防止納米銀粒子的團聚，可在制備過程中加入PVP作為保護劑，達到延緩銀離子還原的效果。

3.2.2 銀溶膠的紫外表征 采用DMF作為還原劑，以PVP作為保護劑制備所得納米銀溶膠的紫外吸收光譜如圖1。其最大吸收位置只有一個，說明所制納米銀溶膠為球型，且其最大吸收峰位于408 nm，根據(jù)文獻[15]推測，此處制得的納米銀直徑在50 nm左右，且半峰寬較窄，說明納米顆粒分布較均勻。

圖1 銀溶膠的紫外表征圖譜

3.3 模擬陽性樣品檢測 將實驗室自行制備的模擬降糖中藥陽性樣品按照“1.4項”下的方法進行檢測，得到結果如圖2所示。以格列喹酮為例，其SERS譜中出現(xiàn)的特征峰476, 499, 527, 610, 634, 663, 679, 743, 783, 808, 821, 834, 1004, 1029, 1090, 1125, 1164, 1188, 1205, 1275, 1349, 1442, 1600, 1615 cm-1(409, 865 cm-1除外)，均可對應于其固體樣品的拉曼光譜中的特征信號(圖3)，其中409、865 cm-1處特征信號來自于銀膠溶劑DMF(圖4)。

圖2 格列類藥物的SERS譜(a)及其常規(guī)拉曼光譜(b)

圖3 格列喹酮的SERS譜(a)及其常規(guī)拉曼光譜(b)

圖4 空白硅膠板滴加銀溶膠的SERS譜(a)及其常規(guī)拉曼信號(b)

采用有機相銀溶膠獲得的格列類降糖藥的SERS圖譜，含有豐富的特征信息，用于定性鑒別時準確性較高，進一步提高了本方法用于中藥摻雜該類物質檢測的專屬性。

3.4 真實樣品檢測 利用建立的方法對7種真實的降糖中藥樣品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)6號樣品中非法添加了格列美脲，與山東省食品藥品檢驗所提供的檢測結果一致。

4 結論

本研究所建立的檢測方法用于降糖類中成藥中非法添加格列類化學藥品的快速檢測時，具有靈敏度高、專屬性強、操作簡單快速、檢測成本低等優(yōu)點，在中藥摻雜快速檢測、食品安全監(jiān)控、農(nóng)藥殘留檢測等領域具有較好的應用前景。

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