不同N/C比納米碳氮膜對(duì)多壁碳納米管抗凝血性能的影響

趙夢(mèng)鯉，李德軍，董 磊，劉小綺，曹 葉

（天津師范大學(xué)物理與材料科學(xué)學(xué)院，天津300387）

碳納米管（CNTs）是繼C60后被發(fā)現(xiàn)的碳的又一同素異形體[1]，由于具有大表面積、封閉的拓?fù)錁?gòu)形、豐富的電子結(jié)構(gòu)、不同的螺旋結(jié)構(gòu)、超輕重量、高化學(xué)和熱穩(wěn)定性以及高機(jī)械強(qiáng)度等特性，碳納米管具有很多獨(dú)特的理化性質(zhì)，因此，在諸如醫(yī)學(xué)診斷治療、生物傳感器和醫(yī)學(xué)材料等研究和應(yīng)用領(lǐng)域受到極大關(guān)注[2-7]，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景.但隨著對(duì)碳納米管生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究的不斷加深，材料本身逐漸暴露出一定的缺陷和問(wèn)題，如碳納米管本身化學(xué)穩(wěn)定性高，一般不溶于任何溶劑，所以在溶液中易聚集成團(tuán)，這既妨礙了對(duì)其進(jìn)行分子水平的操作和研究，也難于將它納入生物體系，導(dǎo)致它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制[8-12].因此，為保留碳納米管本身的優(yōu)異性能，同時(shí)克服強(qiáng)疏水性的缺陷，采用物理或化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行表面修飾是非常必要的.

在近些年的研究[13-15]中，碳氮膜（CNx）被證實(shí)具有良好的生物相容性和潤(rùn)濕性，是一種被認(rèn)可的生物涂層材料.將CNx涂層覆蓋在MWCNTs表面既可在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上保持MWCNTs原有的大比表面積和高孔隙度的優(yōu)勢(shì)，又可借用CNx膜良好的潤(rùn)濕性，從表面性能上提高M(jìn)WCNTs的親水性.本課題組的前期工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在MWCNTs表面沉積納米碳氮膜可以有效提高M(jìn)WCNTs的血液相容性[16-17].進(jìn)一步考慮到作為生命體的必須元素，N元素參與蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞表面識(shí)別等生命活動(dòng)，具有生物活性，因此，N元素在材料中的含量和引入位置對(duì)其生物相容性的改善均有影響[18].本研究選擇可在較低的轟擊能量下連續(xù)沉積任意厚度膜層、并能在室溫下合成具有理想化學(xué)配比化合物膜層的IBAD技術(shù)，通過(guò)控制實(shí)驗(yàn)參數(shù)，調(diào)節(jié)引入N元素的比率，在MWCNTs表面沉積不同N/C比率的納米CNx薄膜，研究不同N含量CNx薄膜對(duì)MWCNTs抗凝血性的影響.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的制備

MWCNTs（中國(guó)深圳市納米港有限公司提供）純度為 90%，直徑為 40～50 nm，長(zhǎng)度為 5～15 μm.為了方便生物實(shí)驗(yàn)，制備的MWCNTs材料需被噴涂在直徑15 mm的圓形SiO2基片上，具體方法為：首先使用CVD設(shè)備在SiO2基片上燒制一層C層，以增加MWCNTs與SiO2基片之間的結(jié)合力；然后，將MWCNTs、十二烷基硫酸鈉（SDS）和去離子水按質(zhì)量比60∶3∶170的比例混合，置于容器中以功率400 W超聲處理10 min后，按轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心15 min，最終形成穩(wěn)定的懸浮溶液；接下來(lái)取懸浮液上層噴涂于基片上，為保證基片上的MWCNTs等量，每個(gè)基片噴涂4 mL碳納米管懸浮液；最后，將噴涂后的樣品置于去離子水中浸泡10 min，后置于蒸鍋內(nèi)高溫高壓（126℃，0.15 MPa）60 min除去SDS，取出后置于烘箱干燥即可.

MWCNTs的表面功能化采用高真空離子束輔助沉積系統(tǒng)（IBAD）.沉積過(guò)程中濺射氣體選用純度均為99.99%的氬氣和氮?dú)?，本底真空?.9×10-4Pa，工作氣壓保持在 1.2×10-2～1.3×10-2Pa.加速電壓為 200 V，放電電壓為70 V，使用濺射槍轟擊純度為99.9%的石墨靶，濺射能量為1.05 keV，濺射束流為25 mA；N離子輔助能量為200 eV，通過(guò)改變輔助槍的束流（5、15和25 mA）調(diào)節(jié)在MWCNTs樣品上所沉積CNx膜的N/C比.

1.2 沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的結(jié)構(gòu)特征測(cè)試

實(shí)驗(yàn)樣品的結(jié)構(gòu)表征采用JEOL JSM-6700F型掃描電子顯微鏡（SEM），極性功能基團(tuán)成分、含量、分布和鍵合狀態(tài)分析使用PHI5000型X線能譜儀（1 486.6 eV的Al Kα射線源），通過(guò)CAM KSV021733型光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)試表面功能化前后水在碳納米管材料樣品上的接觸角.

1.3 沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的抗凝血性測(cè)試

血液相容性中最為關(guān)鍵的部分是血栓生成.采用血小板黏附實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)凝血實(shí)驗(yàn)測(cè)試MWCNTs和沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的抗凝血性能.

取MWCNTs和表面沉積不同N/C比CNx膜的MWCNTs樣品各3片，分別放入24孔板中.陰性對(duì)照組3片，放有與實(shí)驗(yàn)材料同尺寸并涂有2%甲基硅油的SiO2基片；陽(yáng)性對(duì)照組3片，為與實(shí)驗(yàn)材料同尺寸的SiO2基片.健康新西蘭兔耳動(dòng)脈取血10 mL，加入抗凝劑離心10 min，將獲得的富含血小板的血漿滴在樣品、陰性和陽(yáng)性對(duì)照組的表面，并在37℃條件下培養(yǎng)15 min，拿出計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)血小板黏附率.計(jì)算血小板在樣品表面黏附率的方法為：

式（1）中：A為抗凝血中的血小板數(shù)；B為與材料作用后的抗凝血中的血小板數(shù).為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最終結(jié)果取3次平行實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)平均值.另準(zhǔn)備一組，在SEM下觀察樣品表面黏附血小板的形態(tài).

凝血實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)凝血因子、反映凝血機(jī)理的重要手段和指標(biāo).動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)反映了血液中游離的血紅蛋白的溶解狀況和血液在材料表面的凝血程度.實(shí)驗(yàn)取新鮮的健康兔血，每個(gè)樣品上滴加0.1 mL，并開(kāi)始計(jì)時(shí).5、10、20、30、40和 50 min時(shí)依次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)時(shí)每種材料各取出1個(gè)樣品放到含有50 mL蒸餾水的燒杯中，均勻震蕩.此時(shí)沒(méi)有形成血栓的血紅細(xì)胞將被溶解，血紅蛋白自由分散在溶液中，使用天津喀納斯光學(xué)分析儀器有限公司生產(chǎn)的721型分光光度計(jì)，在540 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量樣品的光密度（O.D.540nm），光密度值越高，說(shuō)明形成血栓的紅細(xì)胞越少，材料的抗凝血性越優(yōu)秀.同樣，取3次平行試驗(yàn)的平均值，將O.D.540nm平均值繪成動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間曲線圖.

2 結(jié)果與討論

圖1為噴涂在SiO2表面的MWCNTs的表面形貌.

圖1 樣品的SEM圖Fig.1 SEM images of the samples

從圖1（a）可以看出，噴涂在SiO2基片上的MWCNTs結(jié)構(gòu)疏松，表面粗糙，存在大量孔洞.而在MWCNTs表面沉積CNx膜后，材料表面形貌略微平整，孔洞減少，且隨著輔助槍束流的增大，表面形貌更加平整，如圖 1（b）、1（c）和 1（d）所示.這一方面是因?yàn)?CNx膜包覆在MWCNTs表面，使得材料表面平整；另一方面，隨著束流的增大，被離子束打斷的MWCNTs數(shù)目增多，也填補(bǔ)了MWCNTs材料表面的孔洞，使材料更加平整.通過(guò)實(shí)驗(yàn)前在Si片表面測(cè)試沉積率可知，改變輔助槍束流基本不影響沉積CNx薄膜的厚度，CNx的沉積率為19～20 nm/h.實(shí)驗(yàn)沉積時(shí)間為30 min，因此覆蓋在MWCNTs表面的CNx薄膜厚度約為10nm.

同時(shí)，材料水接觸角的實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出：MWCNTs具有很強(qiáng)的疏水性，接觸角達(dá)到135.80°，如圖2（a）所示.在MWCNTs表面沉積納米CNx膜后，樣品親水性明顯提高，材料由疏水性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性物質(zhì)，如圖 2（b）、圖 2（c）和圖 2（d）所示.由圖 2 可以看出，隨著輔助槍束流的增大，沉積納米CNx膜的MWCNTs親水性不斷提高，當(dāng)束流為25 mA時(shí)，樣品的接觸角達(dá)到最小值24.72°.材料抗凝血性的優(yōu)劣與材料表面的粗糙程度和親水性相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，材料表面越平滑、親水性越好，其抗凝血性就越好[19-20].綜合SEM和接觸角的測(cè)試結(jié)果，在MWCNTs上沉積納米CNx膜可以改善MWCNTs材料的抗凝血性；同時(shí)，隨著輔助槍束流的增大，沉積CNx膜的MWCNTs材料的抗凝血性變得更加優(yōu)異.

圖2 樣品的接觸角圖Fig.2 Contact angle images of the samples

為確定沉積CNx膜MWCNTs中N和C兩元素的含量及成鍵狀態(tài)，對(duì)MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs樣品進(jìn)行XPS分析，結(jié)果如表1和圖3所示.

表1 MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs的原子百分比（%）和結(jié)合能（eV）Tab.1 Atomic content percent and binding energy of MWCNTs with and without CNxcoatings

圖3 樣品的XPS譜圖Fig.3 XPS spectra of the samples

由表1可知，XPS結(jié)果顯示MWCNTs中含有0.53%的N，這是由于制備所得MWCNTs在結(jié)構(gòu)上疏松多孔（如圖1（a）所示），暴露在空氣中，表面吸附有空氣中的N2所致；沉積納米CNx膜的MWCNTs中N含量受輔助槍束流大小的影響，輔助槍束流為5、15和25 mA時(shí)，N元素含量依次為17.04%、21.34%和17.54%，換算成N和C兩原子的比例（N/C）依次為0.20、0.27和 0.21，記為 CN0.20、CN0.27和 CN0.21.由此可見(jiàn)，輔助槍束流的大小與材料含氮量高低相關(guān)，輔助槍束流過(guò)高或過(guò)低均不利于N元素在MWCNTs材料上的積累，為獲得較高的含N量，15 mA的輔助槍束流較為合適.

圖3為表面功能化前后的碳納米管經(jīng)高斯擬合的 C1s和 N1s譜圖.由圖 3（a）可以看出，MWCNTs中只存在C峰，C元素之間以sp2C—C（284.7eV）和sp3C—C（285.6 eV）兩種雜化方式結(jié)合.沉積納米CNx（x=0.20、0.27和0.21）膜的MWCNTs的N1s譜圖顯示，N元素以sp2N—C（400.1 eV）和sp3N—C（398.7 eV）2種鍵合狀態(tài)存在于CNx薄膜中，且從N1s譜圖中可以看出，sp3N—C雜化占主要成分，并且隨著N/C比的增加，sp3N—C鍵的比例也隨之增大.

圖4顯示了MWCNTs和沉積CNx（x=0.20、0.27和0.21）膜MWCNTs樣品表面血小板的黏附率.

圖4 樣品表面的血小板黏附率Fig.4 Adhension rates of platelets on the samples

由圖4可以看出，幾種材料表面血小板黏附的大小依次為：陽(yáng)性對(duì)照組>MWCNTs>沉積CN0.27膜的MWCNTs>沉積CN0.20膜的MWCNTs>沉積CN0.21膜的MWCNTs>陰性對(duì)照組.因此，在碳納米管表面沉積CNx膜有效地抑制了血小板黏附和血栓形成.影響材料抗凝血性能的因素主要有樣品的表面粗糙度、親疏水性和表面電荷分布等.表面粗糙意味著大的表面積，血小板越容易黏附，抗凝血性能就會(huì)越差[21].因此，CNx膜作為一種光滑薄膜覆蓋在MWCNTs表面，可以有效降低材料表面粗糙度，進(jìn)而達(dá)到抑制血小板黏附的目的.由接觸角的測(cè)試結(jié)果可知，沉積CN0.21膜的MWCNTs的親水性最強(qiáng)，因此其表面黏附的血小板數(shù)目最少.此外，血栓在材料表面的形成與纖維蛋白原表面電荷轉(zhuǎn)移到材料表面有關(guān)，當(dāng)纖維蛋白原失去電荷后會(huì)轉(zhuǎn)變成纖維蛋白單體和血纖維蛋白肽，這種交聯(lián)的纖維蛋白單體最終導(dǎo)致血栓的形成[22-23].由CNx薄膜中N原子的電子結(jié)構(gòu)看，5個(gè)價(jià)電子中的4個(gè)形成與C原子價(jià)電子類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，1個(gè)剩余.sp3雜化中，這個(gè)剩余電子將填充到4個(gè)sp3軌道中的任意1個(gè)，形成1個(gè)三角錐形的三鍵和1對(duì)孤對(duì)電子[24-26].所以，沉積CNx薄膜的MWCNTs具有優(yōu)于MWCNTs的抗凝血性的原因是由于CNx薄膜中孤對(duì)電子的存在阻礙了電荷從纖維蛋白原向材料表面的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制了纖維蛋白原向交聯(lián)纖維蛋白單體轉(zhuǎn)化，提高了抗凝血性.

圖5顯示了掃描電鏡下MWCNTs和沉積CNx（x=0.27、0.21）膜MWCNTs材料表面的血小板形態(tài).

圖5 血小板和紅細(xì)胞在不同樣品表面的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of the platelets and red cells adhered on different samples

由圖5（a）可以看出，黏附在MWCNTs表面的部分紅細(xì)胞變形，說(shuō)明MWCNTs對(duì)血小板具有一定的毒副作用；同時(shí)，黏附其上的血小板變形嚴(yán)重，伸出細(xì)長(zhǎng)偽足，團(tuán)聚糾纏在一起，易形成血栓.由圖5（b）和圖5（c）可知，沉積CNx膜的MWCNTs表面紅細(xì)胞呈圓餅狀，無(wú)變形，說(shuō)明表面的CNx膜降低了MWCNTs對(duì)紅細(xì)胞的毒性，且黏附在材料表面的血小板團(tuán)聚少，偽足短小，分布分散，不易形成血栓.對(duì)比圖4（b）和圖4（c）還可以發(fā)現(xiàn)，沉積CN0.21膜的MWCNTs表面血小板最為分散，變形最少，驗(yàn)證了血小板黏附率的測(cè)試結(jié)果.

圖6顯示了MWCNTs和沉積CNx膜MWCNTs的動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間.動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間曲線越平緩，說(shuō)明凝血時(shí)間（O.D.540nm=0.10時(shí)的時(shí)間定為凝血時(shí)間）越長(zhǎng)，凝血因子被激活的程度越低，材料的抗凝血性越好.從圖6中可以發(fā)現(xiàn)，沉積3種不同N/C比CNx膜的MWCNTs的凝血曲線均較MWCNTs的平滑，且OD值達(dá)到0.10的時(shí)間更晚，這說(shuō)明在碳納米管表面沉積CNx膜可以達(dá)到延長(zhǎng)材料動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間的目的，且隨著N/C比的增高，凝血時(shí)間不斷增長(zhǎng)，凝血因子在沉積CNx膜的MWCNTs材料上被激活的程度越低，其抗凝血性越優(yōu)秀.

3 結(jié)論

本研究采用離子束輔助沉積（IBAD）方法在MWCNTs表面沉積納米CNx薄膜，通過(guò)控制氮?dú)廨o助槍束流來(lái)控制薄膜中的含氮量.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在MWCNTs表面沉積納米CNx薄膜可降低MWCNTs材料的表面粗糙度，顯著提高M(jìn)WCNTs的親水性，血液在沉積納米CNx薄膜MWCNTs表面的動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間長(zhǎng)，血小板黏附率低，紅細(xì)胞形態(tài)健康，這說(shuō)明使用物理方法在MWCNTs表面沉積納米CNx薄膜成功達(dá)到了改善MWCNTs抗凝血性的目的.同時(shí)，樣品表面粗糙程度、親水性和抗凝血性的提高對(duì)應(yīng)較高的輔助槍束流和含氮量，說(shuō)明抗凝血性的優(yōu)劣不是單一因素作用的結(jié)果，為達(dá)到最優(yōu)化沉積CNx薄膜MWCNTs抗凝血性的目的，需要綜合考慮N含量、粗糙度和親水性等因素，在盡量提高氮元素含量的同時(shí)減小粗糙度，提高親水性.離子束輔助沉積方法可通過(guò)調(diào)節(jié)轟擊能量和束流大小等條件控制達(dá)到抗凝血性最優(yōu)值，該方法在生物醫(yī)用材料改性方面具有良好的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值.

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