苦物質引起去甲腎上腺素預收縮的大鼠主動脈平滑肌舒張的作用機理研究

劉慶華, 賽文博，于孟飛，談 麗

(中南民族大學 生命科學學院 湖北省武陵山區(qū)資源植物種質改良與利用重點實驗室，武漢 430074)

味覺是哺乳動物的重要感覺之一，而苦味則是人類六種基本味覺中呈味閾值最低的一種. 味覺是人類自我保護的一種重要機制. 因為大部分對人體有毒有害的物質多呈苦味，對苦味的呈遞和抗拒成為了人類避免毒素侵害的第一道防線[1].

現(xiàn)已知TAS2R受體是負責苦味感知的主要受體，在人體和小鼠中分別有25種和36種亞型，它們不僅分布在味蕾上，還在腸道、大腦、呼吸道、血管等諸多部位均有不同程度的表達[2]，這使苦物質舒張血管、氣管的研究成為近期的熱點.大量研究結果表明：苦味劑如氯喹(Chloroquine)和苦精(Denatonium)等能顯著影響平滑肌的舒張與收縮[3, 4],苦味劑能舒張由毒蕈堿受體激動劑引起的氣道肌肉收縮，其作用途徑是通過TAS2R - Gβγ蛋白-PLCβ- IP3- IP3R途徑增加細胞內Ca2+濃度并激活BKs ，最終導致細胞膜去極化而使細胞松弛[5, 6]；但另有研究報道典型苦味劑氯喹還可完全抑制BKs[7].故苦物質的作用機理仍然需要深入研究.

在經典理論途徑中，平滑肌的收縮與細胞胞質內鈣濃度的升高密切相關，故苦物質可能通過抑制胞內Ca2+濃度的升高而實現(xiàn)平滑肌的舒張.本文以肌肉張力換能系統(tǒng)為主要工具，以氯喹和苦精為苦物質的代表，研究了苦物質氯喹在血管平滑肌上的收縮/舒張作用，其內皮組織、組織內部和外部Ca2+在其中所起的作用，并結合多種通道阻斷劑探討其作用通路.通過研究苦物質引起血管收縮/舒張的分子機制，為呼吸道和心血管疾病的預防和治療提供了理論支持.

1 材料

1.1 試劑和儀器

去甲腎上腺素(Norepinephrine, 遠大醫(yī)藥中國有限公司, 國藥準字H42021301), 氯喹(Chloroquine)、苦精(Denatonium)、ROCK的抑制劑(Y27632)、2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB)、茜素紫(Gallein)、硝苯地平(Nifedipine) (美國 Sigma).

生理鹽溶液(2 Ca2+PSS): NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl22 mM, Glucose 10 mM, HEPES 10 mM, MgCl2·6H2O 1mM.無Ca2+PSS (0 Ca2+PSS): NaCl 135 mM, KCl 5 mM, EGTA 0.5 mM, Glucose 10 mM, HEPES 10 mM, MgCl2·6H2O 1 mM.Ca2+母液: CaCl2120 mM.

BL-420S張力換能器、恒溫水浴系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司), PH計(PHS-2F型, 上海精科), 細胞培養(yǎng)箱(INE600型, 德國MEMMERT), 無菌操作臺(BSC11B2-1404型, 蘇潔凈化).

1.2 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠，8～10周齡，150～210 g，購自湖北省疾病預防控制中心.在控溫、控濕的條件下，自由飲水進食.動物實驗和處理均遵照《中南民族大學實驗動物使用與福利指導手冊》.

2 方法

2.1 大鼠的處死和胸主動脈的分離

大鼠飼養(yǎng)48 h后短頸處死，將口腔和四肢釘在解剖板上，腹部噴灑75%的酒精后剪開并向頸部解剖，沿胸腔至頸部結締組織為止.胸腔剪開后，用鑷子小心撥開心肺組織，可見大鼠胸主動脈處于脊椎上方，取胸腔內的主動脈約3 cm立即放入事先置于冰上的PSS溶液中待用.

2.2 胸主動脈的處理及標本上樣

將組織轉至解剖鏡下，兩端固定，使用維納斯剪小心除去外周的結締組織和內腔中的殘留血液，用棉線反復輕柔擦拭血管內壁3次以去除內皮.處理完成后，將動脈剪成長約6 mm的片段后與掛鉤連接，小心銜接張力換能器后置于內有6 mL PSS并持續(xù)通氧的37℃的恒溫水浴槽中.前負荷調至300 mg，開始平衡.平衡期間，每15 min換液1次，共換液4次.平衡完畢后使用80 mM高鉀溶液進行預刺激，充分刺激組織活性后換液洗脫，至恢復至基線.5 min后即可開始試驗.

2.3 G蛋白抑制劑共孵育胸主動脈

將2.1中的血管環(huán)用滅菌的PSS洗2遍后，轉至裝有DMEM的48孔板中，隨即封蓋后放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h.對照組使用DMEM培養(yǎng)基即可，實驗組需加入相應濃度的PTX和Gallein對G蛋白的各個亞基進行阻斷.

3 結果

3.1 去甲腎上腺素對于大鼠胸主動脈的收縮作用

去甲腎上腺素對于大鼠胸主動脈的收縮作用結果見圖1.由圖1a可見，去甲腎上腺素(NE)介導的大鼠胸主動脈血管環(huán)(rTAVR)的收縮作用呈劑量依賴效應.在10 μM時達到最大收縮，當劑量增大至100 μM時對組織的收縮作用不升反降.由圖1b可見，當NE的作用濃度達到1μM時，胸主動脈已經基本達到最大收縮且該濃度不會對組織產生毒害作用.故后續(xù)試驗中以1μM為刺激濃度.

a) NE對rTAVR收縮作用的量效曲線；b) NE對大rTAVR收縮作用的統(tǒng)計圖圖1 NE引起大鼠胸主動脈血管環(huán)收縮效應Fig.1 The constrict effect of NE on rat thoracic aorta

3.2 苦物質對于NE引起rTAVR收縮的舒張作用

苦物質對于NE引起rTAVR收縮的舒張作用結果見圖2.由圖2a和2b可見，Chloroquine和Denatonium兩種藥物均可舒張由NE引起的rTAVR收縮，且這種舒張作用呈劑量依賴效應. 由圖2c和2d可知，當藥物濃度達到2～4 mM時，兩種苦物質均可完全舒張由NE引起的rTAVR收縮.當藥物濃度達到4 mM時，Chloroquine和Denatonium舒張比例分別為(99.74±0.26)%和 (100.00±0.00)% (n=7). 故以Chloroquine和Denatonium為代表的苦物質對大鼠胸主動脈平滑肌具有高效而迅速的舒張作用.

a,c) Chloroquine ; b,d) Denatonium圖2 氯喹和苦精對大鼠胸主動脈環(huán)的舒張作用 Fig.2 The relaxant effect of Chloroquine and Denatonium on rat thoracic aorta

3.3 內皮細胞對于Chloroquine引起的舒張作用的影響

血管內皮細胞具有強大的內分泌功能，包括自分泌和旁分泌，它們可產生內皮源的收縮和舒張物質，如一氧化氮超極化舒張因子和內皮素等[8].為了闡明血管內皮細胞在Chloroquine介導的NE預收縮的血管平滑肌的舒張過程中的作用，實驗先使用NE對rTAVR進行預收縮，再使用乙酰膽堿(Ach)對內皮完整的血管環(huán)產生舒張作用證明內皮是否被去除[9]，結果見圖3.由圖3可見，內皮完整組和去內皮組的血管環(huán)的收縮都均被3mM Chloroquine完全地舒張，其舒張比例分別為(99.89±0.1)% 和(99.97±0.03)% (n=3,p>0.05).故Chloroquine對血管的舒張作用不依賴內皮組織介導的，它與內皮源性的舒張因子無關，提示Chloroquine是直接作用于血管平滑肌而導致血管舒張.

a) 內皮去除組; b) 內皮完整組 圖3 內皮組織在氯喹起的大鼠胸主動脈環(huán)舒張作用中的影響Fig.3 The effect of endothelium on Cloroquine-induced relaxation in rat thoracic aorta

3.4 Chloroquine對NE介導的胞內鈣升高的抑制作用

經典的平滑肌收縮理論認為平滑肌收縮同平滑肌細胞漿內的鈣濃度密切相關.胞漿內鈣濃度升高主要通過細胞外Ca2+經由細胞膜上的電控或配體型離子通道，如L型鈣通道等進入胞漿，或者由IP3引起肌質網存儲的細胞內鈣釋放繼而導致胞漿鈣濃度升高.本實驗通過研究Chloroquine對NE引起的內鈣濃度升高的兩條途徑的阻斷作用闡明苦物質引起血管舒張的信號通路，結果見圖4.由圖4a可知，在3 mM Chloroquine預處理20 min后，NE在0 mM Ca2+PSS和2 mM Ca2+PSS溶液中均不能引起收縮.由圖4b可知，0 mM Ca2+條件下，NE可引起內鈣釋放而引起平滑肌細胞的小幅度收縮.隨后，“恢復”平滑肌組織外液Ca2+濃度至正常2 mM，肌張力顯著升高.在血管平滑肌收縮達到平臺期后，3 mM Chloroquine可完全舒張NE引起的收縮.以上結果有力地證明了NE可同時阻斷平滑肌細胞內鈣釋放和外鈣流入而引起預收縮的血管平滑肌發(fā)生舒張，提示Chloroquine可能通過阻斷IP3受體介導的內質網鈣庫的釋放而引起血管舒張.

a,b) Chloroquine阻斷NE引起的rTAVR收縮作用;c,d) NE引起rTAVR收縮作用及Chloroquine對其的舒張作用圖4 Chloroquine對平滑肌細胞內鈣釋放和外鈣流入通路的阻斷Fig.4 The inhibitory effect of Chloroquine of the release of intracellular calcium stores and extracellular influx

3.5 Chloroquine作用通路的研究

為闡明Chloroquine除阻斷內鈣釋放和外鈣流入之外的引起血管平滑肌舒張的其他信號通路，本實驗通過使用各種離子通道阻斷劑(Y27632、Gallein、Gd3+、2-APB、Nifedipine)阻斷不同的信號通路來研究Chloroquine舒張血管平滑肌的機制.Y27632為RhoA通路阻斷劑， RhoA-2ROK通路可介導鈣敏感性降低引起的血管平滑肌收縮，這種收縮是鈣非依賴性的，它主要通過磷酸化作用抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的活性來增加肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化水平，從而增強平滑肌的收縮力[10].Gallein為G蛋白β和γ亞基的阻斷劑，苦味的呈遞是由G蛋白介導的，故可通過阻斷G蛋白的β和γ亞基探明Chloroquine的阻斷作用是否直接作用于G蛋白[11].Gd3+為三價陽離子，可阻斷一系列三價和三價以下陽離子通道，統(tǒng)稱非選擇性陽離子通道(NSCC)[12]，其中包括Ca2+、Na+、K+等.2-APB是TRPC通道的阻滯劑，TRPC通道為氯離子通道的一種，它與膜受體激活、Ca2+儲存釋放、細胞膜脂質和運輸?shù)榷喾N細胞活動相關[13].Nifedipine為L型鈣通道特異性阻滯劑，L型鈣通道是一種電壓依賴性鈣通道的類型鈣通道，是介導外鈣進入胞漿的最主要途徑之一，故也是影響血管平滑肌收縮和舒張的重要途徑之一.

在37℃，充分通氧條件的水浴槽內使用以上多種阻斷劑對平衡后的rTAVR預處理20 min后(Gallein在細胞培養(yǎng)箱中預處理6～8 h)，使用1μM NE進行收縮，待收縮穩(wěn)定后再使用3 mM Chloroquine對血管環(huán)進行舒張.圖5a為NE引起收縮的統(tǒng)計圖，圖5b為Chloroquine舒張比例的統(tǒng)計圖.從圖5可見， Y27632預處理的血管環(huán)在收縮上與對照組并無差異(p>0.05,n=5)，對Chloroquine的收縮并未起到任何阻斷作用，故Chloroquine并未通過RhoA舒張NE預收縮的血管平滑肌. Gallein(n=4)、NSCC (n=3) 和TRPC (n=3) 通路也未在這種舒張作用中發(fā)揮作用.但Nifedipine可以顯著舒張NE預收縮的血管平滑肌(p=0.025<0.05,n=4).說明L型鈣通道很可能是NE引起血管環(huán)收縮的外鈣進入細胞途徑之一，結合圖3a中Chloroquine對NE的完全阻斷作用可知，L型鈣通道的阻斷是Chloroquine舒張血管平滑肌過程中一條重要原因.

a) 各種通道阻斷劑對于NE引起rTAVR收縮的阻斷作用；b) 各種通道阻斷劑對于ChloroquinerTAVR舒張的阻斷作用圖5 Chloroquine引起預收縮的血管平滑肌舒張的機理Fig.5 The mechanism of Chloroquine-induced relaxation in precontracted thoracic aortic smooth muscle

4 討論

本文首次發(fā)現(xiàn)了以Chloroquine和Denatonium為代表的苦物質對于NE介導的rTAVR的收縮具有快速、高效的舒張作用，初步探討了苦物質Chloroquine舒張大鼠胸主動脈平滑肌的作用機理，結果表明：(1)Chloroquine可阻斷NE引起的動脈平滑肌肌質網鈣庫的釋放；(2)Chloroquine引起的舒張作用與內皮細胞介導的血管平滑肌舒張和RhoA通路相關的鈣敏感機制無關；(3)Chloroquine可阻斷L型鈣通道，這也是引起血管平滑肌舒張的主要作用之一，即Chloroquine可同時阻斷平滑肌細胞外鈣流入和內鈣釋放這兩條信號通路來調節(jié)肌肉的收縮與舒張.

本文還探討了其他與平滑肌內鈣升高有關信號通路在苦物質引起的肌肉舒張過程中的作用，但并未驗證出除L型鈣通道阻斷以外的其他通路，推測 Chloroquine可能作用于鈣調蛋白或其他靶分子從而影響肌球蛋白輕鏈的磷酸化作用，造成平滑肌舒張，而且這種舒張作用與離子通道的關閉或開放無關；或者苦物質可能直接作用于肌球蛋白輕鏈，直接抑制其去磷酸化位點，強制舒張平滑肌；可能由于Chloroquine作用于鈉鈣交換體或鈉泵等蛋白，從而降低胞漿內的鈣濃度，造成舒張[8].這些問題仍有待深入研究，為其成為高血壓藥物的研究奠定功能性基礎.

參 考 文 獻

[1] 景芳邈, 劉穎璐, 楊 寧, 等.苦味受體及其研究進展[J].山東醫(yī)藥,2012,52(15):85-88.

[2] 胡玲玲, 施 鵬. 苦味受體基因家族功能和演化研究的最新進展[J].科學通報 2009,54(17):2472-2482.

[3] Deshpande D A, Wang W C, McIlmoyle E L, et al. Bitter taste receptors on airway smooth muscle bronchodilate by localized calcium signaling and reverse obstruction[J]. Nat Med ,2010,16(11):1299-1304.

[4] Belvisi M G, Dale N, Birrell M A, et al. Bronchodilator activity of bitter tastants in human tissue[J]. Nat Med, 2011,17(7):776-778.

[5] An S S, Wang W C, Koziol-White C J, et al. TAS2R activation promotes airway smooth muscle relaxation despiteβ(2)-adrenergic receptor tachyphylaxis[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2012,303(4):L304-311.

[6] An S S, Robinett K S, Deshpande D A, et al. Reply to: Activation of BK channels may not be required for bitter tastant-induced bronchodilation[J]. Nat Med ,2012,18(5):650-651.

[7] Zhang C H, Lifshitz L M, Uy K F, et al. The cellular and molecular basis of bitter tastant-induced bronchodilation[J]. PLoS Biol, 2013,11(3):e1001501.

[8] 陳永健, 周永列, 胡慶豐, 等. 高血壓病人血管內皮標志物與內皮依賴性血管舒張功能的關系[J].放射免疫學雜志, 2009, 22(6):579-582.

[9] Tagashira H, Matsumoto T, Taguchi K, et al. Vascular endothelial σ1-receptor stimulation with SA4503 rescues aortic relaxation via Akt/eNOS signaling in ovariectomized rats with aortic banding[J]. Circ J , 2013,77:2831-2840.

[10] 張 婷. 糖皮質激素對去甲腎上腺素介導血管平滑肌細胞收縮快速調節(jié)作用的信號轉導通路[D].上海:第二軍醫(yī)大學，2011.

[11] Hoot M R, Sypek E I, Reilley K J, et al. Inhibition of Gβγ-subunit signaling potentiates morphine-induced antinociception but not respiratory depression, constipation, locomotion, and reward[J]. Behav Pharmacol, 2013,24(2):144-152.

[12] Takai Y, Sugawara R, Ohinata H, et al. Two types of non-selective cation channel opened by muscarinic stimulation with carbachol in bovine ciliary muscle cells[J]. J Physiol, 2004,559(Pt 3):899-922.

[13] Clapham D E. SnapShot: mammalian TRP channels[J]. Cell, 2007,129(1):220.

[14] Zubare-Samuelov M, Shaul M E, Peri I, et al. Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and sweet tastants: potential role in taste signal termination[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2005, 289(2):C483-492.