手性HPCE整體柱非衍生化法拆分苯丙氨酸

沈靜茹，張 祎，吳天驕，余學(xué)紅，柯雅莉

(1 中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2 中南民族大學(xué) 校醫(yī)院，武漢 430074)

苯丙氨酸又稱α-氨基-β-苯丙酸(縮寫(xiě)phe)，有一個(gè)手性碳(圖1)，一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體.L-苯丙氨酸具有生物活性，是高血壓、心臟病、糖尿病人理想的甜味劑，還是合成抗病毒和抗癌藥物的原料；D-苯丙氨酸能增加人體的免疫功能，具有強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，還可作為生產(chǎn)艾滋病毒抑制劑的藥物中間體，被廣泛應(yīng)用[1].高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法成為商用儀器后[2]，因其分離效率高、分析時(shí)間短和樣品用量少等特點(diǎn)，大規(guī)模用于分離分析，特別是在手性化合物的分析測(cè)定方面[3,4].Zou Min等[5]使用HPCE儀，通過(guò)監(jiān)控溶質(zhì)的紫外吸收峰和計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)的效率關(guān)系，建立了測(cè)量苯丙氨酸含量的方法.Li Q等[6]在FITC熒光標(biāo)注氨基酸后，用高速自動(dòng)化HPCE系統(tǒng)檢測(cè)苯丙氨酸樣品.Yang BC等[7]也采用熒光標(biāo)記樣品，HPCE分離檢測(cè)苯丙氨酸含量.Li Lian等[8]用加熱法制成均一穩(wěn)定的硅膠毛細(xì)管微柱，采用凝膠電泳技術(shù)分離苯丙氨酸，上述方法均只適用于外消旋體的含量測(cè)定.人工合成的苯丙氨酸多為外消旋體，傳統(tǒng)的拆分方法中，苯丙氨酸的分離大都通過(guò)手性衍生的間接方法[9].β-環(huán)糊精(β-CD)及其衍生物是常用的手性選擇劑[10-12],通過(guò)在β-CD支鏈上引入特定的結(jié)構(gòu)側(cè)鏈和官能團(tuán)來(lái)提高手性分離能力.Li等[13]采用PLS最小二乘法結(jié)合紫外可見(jiàn)光譜測(cè)量苯丙氨酸對(duì)映體含量，該法將樣品衍生，通過(guò)化學(xué)計(jì)量法推算單一對(duì)映體的含量.近年來(lái)，有一些HPCE拆分苯丙氨酸的工作，如張春雨等[14]以DOCB-β-CD作為流動(dòng)相手性添加劑，利用HPCE對(duì)氨基酸和手性藥物對(duì)映體進(jìn)行拆分研究，D,L-苯丙氨酸達(dá)到基線分離，該法需消耗大量手性添加劑，且操作繁瑣.

本文利用自制的雙-(6-氧-間羧基苯磺?；?-β-CD(簡(jiǎn)稱β-CD-M1)作為手性選擇劑，不僅保留了β-CD疏水空腔的立體選擇性，而且引入了羧基和苯磺?；功?CD衍生物具有良好的水溶性，將其作為固定相中單體，制備出性質(zhì)穩(wěn)定的HPCE有機(jī)整體柱，用于拆分苯丙氨酸，無(wú)需樣品柱前衍生，找到了最佳的分離條件，分離度Rs可達(dá)4.46.該方法為分離該対映異構(gòu)體及其單一對(duì)映體含量測(cè)定提供了一種HPCE整體柱拆分的新思路.同時(shí)，方法簡(jiǎn)單、高效、低消耗，且符合綠色化學(xué)要求.

圖1 苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of phenylalanine

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

高效毛細(xì)管電泳儀(P/ACETMMDQ型, 美國(guó)BACKMAN)，酸度計(jì)(ZD-2型, 自動(dòng)電位滴定儀，上海偉業(yè)儀器廠)，超聲波清洗器(KS-80D型,寧波科生儀器廠)，電子分析天平(FA2004型, 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，電磁攪拌器(7901型,上海華光儀器儀表廠)，融硅石英毛細(xì)管(75μm ID, 有效長(zhǎng)度

55cm, 河北永年光纖廠)，微孔濾膜(0.22 μm,上海市新亞凈化儀器廠) .

三羥甲基氨基甲烷(Tris, 上海山浦化工有限公司)，磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(信陽(yáng)市化學(xué)試劑廠)，D-苯丙氨酸(上海晶純?cè)噭┯邢薰?，L-苯丙氨酸(武漢中合科技發(fā)展有限公司)， 超純水(美國(guó) Moleculer 超純水機(jī))， 雙-(6-氧-間羧基苯磺?；?-β-環(huán)糊精(按文獻(xiàn)[15]合成)，其他試劑均為分析純.

1.2 電泳條件

電泳柱：雙-(6-氧-間羧基苯磺?；?-β-CD (β-CD-M1)制備的整體柱(參照文獻(xiàn)[16]制備)；流動(dòng)相：Tris-H3PO4緩沖液， 按實(shí)驗(yàn)需要配置成不同濃度和pH；所有溶液均經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾；設(shè)置好分離電壓和檢測(cè)波長(zhǎng)，電泳整體柱每次運(yùn)行前，用Tris-H3PO4緩沖液沖洗1h，采用壓力進(jìn)樣；所有溶液均在室溫下配制.

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖液pH值對(duì)分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm，工作電壓25 kV，6.2×10-3mol/L苯丙氨酸，進(jìn)樣壓力0.5 psi，進(jìn)樣時(shí)間10 s，柱溫25 ℃，緩沖液Tris-H3PO4的總濃度50 mmol/L的電泳條件下，改變緩沖液的pH值，依次為2.5、2.6、2.9、3.0、3.2、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、4.9、5.0，兩對(duì)映體拆分的HPCE結(jié)果如圖2所示.

a) pH 3.0；b) pH 3.2；c) pH 3.7；d) pH 4.6；e) pH 4.8；f) pH 5.0圖2 緩沖液pH對(duì)苯丙氨酸手性分離的影響Fig.2 Effect of the buffer pH on the separation of phenylalanine enantioseparation

酸度對(duì)分離度影響結(jié)果如圖3所示.由圖3可見(jiàn)，當(dāng)pH≤3.0(pH 2.5～3.0)時(shí)，苯丙氨酸兩對(duì)映體無(wú)拆分跡象；隨著pH值的增大，苯丙氨酸對(duì)映體開(kāi)始分離，且基線平穩(wěn).pH≥5.0時(shí)，也無(wú)法拆分苯丙氨酸對(duì)映異構(gòu)體.苯丙氨酸的等電點(diǎn)pI為5.48，緩沖液pH值的變化影響了苯丙氨酸兩對(duì)映體表面的帶電量，進(jìn)而改變了兩對(duì)映體在電場(chǎng)中的遷移速度.當(dāng)緩沖液的pH<5.48時(shí)，溶質(zhì)荷凈正電荷，僅在pH 3.4～4.8的環(huán)境下兩對(duì)映體帶電量差異較大，粒子遷移的總速度為電泳淌度和電滲流之和，在此酸度范圍內(nèi)整體柱有手性分離苯丙氨酸的能力.當(dāng)pH為4.6時(shí)，苯丙氨酸對(duì)映體完全分離，分離度Rs值最大，前后峰對(duì)稱性良好，洗脫強(qiáng)度和基線均較理想.故選取pH4.6為緩沖液的最佳分離pH值，最佳分離酸度范圍為pH 3.4～4.8.

圖3 不同pH對(duì)苯丙氨酸分離度的影響Fig.3 Effect of different pH buffers on the separation of phenylalanine enantioseparation

2.2 緩沖液濃度對(duì)分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm，工作電壓25 kV，6.2×10-3mol/L苯丙氨酸，進(jìn)樣壓力0.5 psi，進(jìn)樣時(shí)間10 s，柱溫25 ℃，pH 4.6緩沖液Tris-H3PO4的電泳條件下，改變緩沖液Tris-H3PO4的濃度分別為20,30,40, 50, 60 mmol/L，分離結(jié)果如圖4所示.

a) 40 mm/L；b) 50 mm/L；c) 60 mm/L圖4 緩沖液濃度對(duì)苯丙氨酸手性分離的影響Fig.4 Effect of the buffer concentration on the separation of phenylalanine enantioseparation

上述條件下分離度數(shù)據(jù)如表1.由表1可見(jiàn)，隨著緩沖液濃度的增大，溶液粘度增大，電滲流降低，苯丙氨酸在毛細(xì)管內(nèi)的遷移時(shí)間延長(zhǎng).在2.2實(shí)驗(yàn)條件考察中，當(dāng)緩沖液濃度高于60 mmol/L，后峰的出峰時(shí)間在60 min之后，實(shí)際分析中不適用；當(dāng)濃度低于30 mmol/L的情況時(shí)，兩峰部分重疊，未達(dá)到基線分離.故緩沖液濃度為50 mmol/L為最佳分離濃度，此時(shí)緩沖液對(duì)苯丙氨酸兩對(duì)映體的洗脫強(qiáng)度適宜，分析時(shí)間和分離度適中，基線平穩(wěn)，對(duì)映體達(dá)到完全分離.

表1 不同緩沖液濃度對(duì)苯丙氨酸對(duì)映體分離的影響

2.3 不同電壓對(duì)分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm，6.2×10-3mol/L苯丙氨酸，進(jìn)樣壓力0.5 psi，進(jìn)樣時(shí)間10 s，柱溫25 ℃，緩沖液Tris-H3PO450 mol/L，pH 4.6的電泳條件下，分別考察電壓為23、25、28 kV時(shí)苯丙氨酸的分離情況，如圖5所示.由圖5可見(jiàn)，電壓為25 kV時(shí)基線平穩(wěn)，分析時(shí)間適當(dāng)，分離度大.故最佳分離電壓為25 kV.

a ) 23 kV；b) 25 kV；c) 28 kV圖5 電壓對(duì)苯丙氨酸對(duì)映體分離的影響Fig.5 Effect of voltages on the separation of phenylalanine enantioseparation

2.4 方法評(píng)價(jià)

2.4.1 苯丙氨酸對(duì)映體拆分的線性范圍

在β-CD-M1為單體制備的手性HPCE整體柱上，Tris-H3PO4緩沖液50 mmol/L，pH 4.6，進(jìn)樣0.5 psi，10 s，分離電壓25 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫25 ℃，用濃度為2.1×10-3～1.0509×10-2mol/L苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，考察苯丙氨酸的線性范圍，L-苯丙氨酸峰高-濃度線性關(guān)系為y=4.55×102+3.12×105x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9916；峰面積-濃度線性關(guān)系為y=5.25×103+5.00×106x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9942；D-苯丙氨酸峰高-濃度線性關(guān)系為y= 4.68×102+1.24×104x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9952；峰面積-濃度線性關(guān)系為y=1.29×104+1.42×106x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9341.由此初步確定，若以峰高為定量參數(shù)可定量測(cè)定苯丙氨酸兩對(duì)映體的含量，若以峰面積為定量參數(shù)則只能對(duì)L-苯丙氨酸進(jìn)行定量測(cè)定.

2.4.2對(duì)比實(shí)驗(yàn)

在HPCE最佳分離條件下，用純水作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)純水樣時(shí)基線平穩(wěn)，排除了樣品配置中水溶液在同一分離條件下的影響.分別在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱和空毛細(xì)管電泳柱中對(duì)比了拆分苯丙氨酸兩對(duì)映體的分離情況.在空毛細(xì)管電泳柱上用同樣的Tris-H3PO4緩沖液，無(wú)法洗脫苯丙氨酸兩對(duì)映體，如圖6曲線b所示，而該緩沖液在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，在最佳分離條件下，不僅對(duì)兩對(duì)映體有較強(qiáng)的洗脫能力，還有較好的拆分效果，如圖6曲線a所示，D,L苯丙氨酸兩對(duì)映體分離度可達(dá)到4.46.

3 結(jié)語(yǔ)

制備了β-CD-M1手性HPCE整體柱，將其用于拆分D,L-苯丙氨酸，考察了緩沖液的酸度、濃度和分離電壓等條件對(duì)分離的影響，對(duì)比了空柱的分離效果，建立了新的高效毛細(xì)管電泳手性整體柱拆分無(wú)衍生化苯丙氨酸的方法.結(jié)果表明：通過(guò)對(duì)β-CD改性，用間羧基苯磺酰基修飾后，彌補(bǔ)了β-CD自身的不足.苯丙氨酸結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)能在β-CD衍生物的腔體內(nèi)產(chǎn)生包合作用，與衍生物上的苯環(huán)也可產(chǎn)生π-π共軛作用，同時(shí)，樣品中存在的羧基、氨基基團(tuán)能與衍生物中的羥基、羧基等極性基團(tuán)產(chǎn)生相互誘導(dǎo)的極化作用，使苯丙氨酸對(duì)映異構(gòu)體在適宜的條件下達(dá)到完全分離.實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性好，在pH 4.6， 50 mmol/L的Tris- H3PO4緩沖液中進(jìn)樣0.5 psi、10 s，工作電壓25 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm條件下，D,L苯丙氨酸兩對(duì)映體得到基線分離，分離度Rs達(dá)到4.46.

a)整體柱；b)空柱圖6 苯丙氨酸對(duì)映體在不同毛細(xì)管柱下的分離Fig.6 The separation of phenylalanine enantioseparation with different column

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Pogson C I, Knowles R G, Salter M. The control of aromatic amino acid catabolism and its relationship to neurotransmitter amine synthesis[J]. Crit Rev Neurobiol, 1989, 5(1): 29-64.

[2] Cemil Aydogan, Fatma Yilmaz, Duygu Cimen, et al. Enantioseparation of aromatic amino acids using CEC monolith with novel chiral selector, N-methacryloyl- L -histidine methyl ester[J]. Electrophoresis, 2013, 34(13): 1908-1914.

[3] Allen D, Rassi Z E. Silica-based monoliths for capillary electrochromatography: methods of fabrication and their applications in analytical separations[J]. Electrophoresis, 2003, 24(22/23): 3962-3976.

[4] Weinberger R. Practical capillary electrophoresis[M]. Academic Press: Amsterdam, 2000.

[5] Zou M,Han Y L, Qi L,et al.Fast and accurate measurement of diffusion coefficient by Taylor′s dispersion analysis[J]. Chin Sci Bull, 2007, 52(24):3325-3332．

[6] Li Q, Zhang T, Zhu Y Q, et al. Automated high-speed CE system for multiple samples[J]. Electrophoresis, 2013, 34(4): 557-561.

[7] Yang B C, Tan F, Guan Y F. A laser diode double-pumped solid-state laser-induced fluorescence detector for capillary electrophoresisand liquid chromatography[J]. LCGC North America, 2005, 23(10): 1100-1112.

[8] Li L, He Y Z, Gan W E, et al. Electrophoretic separa-tion with 2-mm inner diameter fused-silica microcolumn packed with quartz microncrystals and its application[J]. Talanta, 2009, 79(2): 460-465.

[9] István Ilisz, Anita Aranyi, Antal Péter. Chiral derivati-zations applied for the separation of unusual amino acid enantiomers by liquid chromatography and related techniques[J]. J Chromatogr A, 2013, 1296(28):119-139.

[10] Reijenga J C, Ingelse B A, Everaerts F M. Thermody-namics of chiral selectivity in capillary electrophoresis: separation of ibuprofen enantiomers withβ-cyclodextrin[J].J Chromatogr A, 1997, 792(1/2) : 371-378.

[11] Wang H S, Jiang P, Zhang M, et al. Synthesis of a novel restriacted access chiral stationary phase based on atom transfer radical polymerization and click chemistry for the analysis of chiral drugs in biological matrices[J].J Chromatogr A, 2011, 1218(9): 1310-1313.

[12] Tian Y, Zhong C, Fu E, et al. Novel beta-cyclodextrin derivative functionalized polymethacrylate-based monolithic columns for enantioselective separation of ibuprofen and naproxen enantiomers in capillary electrochromatography[J]. J Chromatogr A, 2009, 1216(6): 1000-1007.

[13] Li Q, Duan J, WU L J, et al. Sucrose as chiral selector for determining enantiomeric composition of phenyla-lanine by UV-vis spectroscopy and chemometrics[J]. Chin Chem Lett, 2012, 23(9): 1055-1058.

[14] 張春雨, 李英杰, 郝秀菊,等. 毛細(xì)管電泳法手性拆分4種氨基酸和2種手性藥物對(duì)映體[J]. 應(yīng)用化學(xué), 2011, 28(11): 1055-1058.

[15] 丁志剛, 劉學(xué)群, 詹國(guó)慶, 等.β-CD與間羧基苯磺酰氯及Fe3+構(gòu)筑氧化還原酶[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 1995, 53(6): 578-582.

[16] 蔡 薇. 雙-(6-氧間羧基苯磺?；?-β-環(huán)糊精HPCE整體柱拆分手性藥物[D]. 武漢: 中南民族大學(xué), 2013.