大豆異黃酮對動脈粥樣硬化大鼠炎癥分子相關基因表達的影響

羅潔，秦旭，韋余，錢民章

（1.遵義醫(yī)學院生物化學教研室，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義563003）

大豆異黃酮對動脈粥樣硬化大鼠炎癥分子相關基因表達的影響

羅潔1，秦旭1，韋余2，錢民章1

（1.遵義醫(yī)學院生物化學教研室，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義563003）

目的：研究大豆異黃酮（soybean isoflavone，SIF）對動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）大鼠血管中促As炎癥相關基因表達的影響。方法：建立As大鼠模型，隨機分成正常組、模型組、模型給藥組和正常給藥組；HE染色觀察各組大鼠胸主動脈病理改變；實時PCR和免疫組化檢測血管中促As炎癥的相關基因表達量。結果：模型組胸主動脈嚴重萎縮、鈣化，出現(xiàn)硬化斑塊；模型給藥組As病變較模型組明顯減輕；正常組和正常給藥組胸主動脈無病理改變。模型組胸主動脈中單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、CC類趨化因子受體2（C-C chemokine receptor，CCR2）、單核細胞趨化蛋白-1誘導蛋白（MCPIP）和C反應蛋白（CRP）mRNA表達量較正常組明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；模型給藥組上述4種基因mRNA表達量均較模型組明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）；正常組與正常給藥組4種基因mRNA表達量間的差異無統(tǒng)計學意義。免疫組化結果顯示，與正常組比較，模型組MCPIP、MCP-1、核因子κB（NF-κB）陽性染色和范圍均增多（P＜0.01），模型給藥組3種蛋白的陽性染色和范圍都較模型組明顯減少（P＜0.05）；正常組和正常給藥組3種蛋白表達間的差異無統(tǒng)計學意義。結論：大豆異黃酮能顯著降低促As炎癥的相關基因表達，明顯抑制大鼠As病變。

動脈粥樣硬化；大豆異黃酮；單核細胞趨化蛋白-1／CC類趨化因子受體2；單核細胞趨化蛋白-1誘導蛋白；C反應蛋白；核因子κB

大豆異黃酮（soybean isoflavone，SIF）是食品大豆中的一類具有雌激素樣作用的生物活性物質，主要成分有染料木黃酮（genistein，Gn）、大豆素（daidzein）和大豆苷元（isoflavones aglycone）。研究發(fā)現(xiàn)，每天攝入一定量的大豆異黃酮可使血液中膽固醇下降7%～10%，冠心病的危險性減少15%～20%［1］。進一步的研究表明大豆異黃酮可通過降血脂、抗氧化、抑制血栓形成等作用抗動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）［2］。目前SIF已作為保健品投放市場，并受到中老年人特別是絕經(jīng)后婦女的關注。

As是一個多因素參與的復雜疾?。?］，發(fā)病機制至今尚未完全明了。Ross［4］在損傷反應學說的基礎上明確提出：As是一種炎癥性疾病而不是單純的由于脂質的沉積所致。國內外的研究均發(fā)現(xiàn)，炎性相關分子單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）及其特異性受體CCR2（C-C chemokine receptor）、單核細胞趨化蛋白-1誘導蛋白（monocyte chemotactic protein-1 induced protein，MCPIP）、C反應蛋白（CRP）在其病變形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。我們前期的工作發(fā)現(xiàn)，SIF中的主要成分染料木黃酮能通過抑制核因子κB（NF-κB）的激活抑制氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的血管平滑肌細胞中MCP-1的表達［6］，還能抑制肝細胞中CRP表達［7］，提示SIF抗As的作用與減少炎癥相關分子表達有關。本研究通過建立大鼠As模型，在整體水平觀察SIF對As病變形成及炎癥相關基因表達的影響，旨在進一步闡明SIF抗As的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠41只，體質量220～300 g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物中心提供，合格證號SCXK（渝）2007 0005。

1.2 藥物及試劑

1.2.1 藥物 大豆異黃酮膠囊（原產(chǎn)地：美國康麥斯保健品公司；經(jīng)銷處：上?？蝶溗贡＝∑酚邢薰?；批號：POMONA CA91766 USA；規(guī)格：500 mg／粒，每粒含大豆異黃酮50 mg；用法用量：每日1次，每次1粒）。維生素D3（生產(chǎn)廠家：北京索萊寶生物科技有限公司；規(guī)格：1 g，4 000萬IU／g；生產(chǎn)批號：V8070）。水合氯醛（生產(chǎn)廠家：國藥集團化學試劑有限公司；生產(chǎn)批號：20071226；規(guī)格：250 g）。

1.2.2 試劑 甲醛溶液（重慶川江化工有限公司，生產(chǎn)批號：20120210，規(guī)格：500 mL）；兔抗MCP-1、MCPIP、NF-κB多克隆抗體（北京博奧森公司產(chǎn)品）；免疫組化檢測試劑盒（基因科技上海有限公司，批號：GK500705）；反轉錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司）；Trizol（寶生物工程大連有限公司），DEPC（焦碳酸二乙酯），SYBR Permix Ex TaqTMⅡ（寶生物工程大連有限公司）；引物均由寶生物工程大連有限公司合成。

1.3 儀器

實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），Eppendorf Master-cycler Gradient PCR儀（德國Eppendorf公司），Centrifuge 5415D離心機（德國Eppendorf公司），NanoDrop2000微量紫外分光光度計（美國Thermo公司），Leica光學顯微鏡及照相系統(tǒng)（德國）。

1.4 方法

1.4.1 大鼠As模型的建立、分組及給藥方法 大鼠用普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組、模型組、模型給藥組、正常給藥組。正常對照組、正常給藥組飼以普通飼料，正常給藥組每天用SIF灌胃，正常對照組每天用等量蒸餾水灌胃。模型組、模型給藥組飼以高脂飼料（82.5%普通飼料、10%豬油、2%膽固醇、5%蔗糖、0.5%膽鹽、0.2%丙硫氧嘧啶），并加用維生素D3溶液（以食用植物油為溶劑溶解維生素D3，按60萬IU／kg給藥）灌胃建立大鼠As模型，間隔30 d后重復給維生素D3溶液30萬IU／kg；從制模第2天起，模型給藥組每天用SIF灌胃，模型組以等量蒸餾水灌胃。每天的SIF劑量計算方法：成人每天用SIF劑量（50 mg）÷60÷ 0.162×5（mg／kg），得出大鼠每天給SIF劑量為26 mg／kg。將市售大豆異黃酮去膠囊取粉末，用雙蒸水配制成0.26 g／100 mL的混懸液，按大鼠體質量1 mL／100 g給藥。

1.4.2 取材 實驗7周后，禁食12 h，稱重，用7%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5 mL／100 g），取下大鼠胸主動脈，剪下一段置于10%中性甲醛溶液中，用于制作切片，另再剪下一段置于Trizol中，－80℃存放，用于組織RNA提取。

1.4.3 胸主動脈病理形態(tài)學觀察 組織在10%中性甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度4μm），HE染色，光鏡下觀察其病理改變，用圖像分析系統(tǒng)采集圖像并在顯微鏡下拍照。

1.4.4 實時PCR檢測血管中MCPIP、MCP-1、CCR2、CRPmRNA的表達量 按一般RNA提取步驟提取RNA，用NanoDrop2000微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度，光密度值在1.8～2.1為理想值。采用Eppendorf Master-cycler Gradient PCR儀反轉錄后，用實時熒光定量PCR儀進行擴增。

MCP-1引物序列：上游5′-CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，擴增產(chǎn)物片段長度146 bp；MCPIP引物序列：上游5′-TCGGCCAGATGTGCCTATCA-3′，下游5′-CTTGGAGGTCCCGGTATGTGTC-3′，擴增產(chǎn)物片段長度191 bp；CCR2引物序列：上游5′-TGTGAGGCTCATCTTTGCCATC-3′，下游5′-CAACCTGCATGGCCTGGTCTA-3′，擴增產(chǎn)物片段長度145 bp；CRP引物序列：上游5′-TTGACGCGAATCAGTCTTTG-3′，下游5′-CATTGGGGCTGAATACCCTA-3′，擴增產(chǎn)物片段長度114 bp；β-肌動蛋白引物序列：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGTCTTT-3′，擴增產(chǎn)物片段長度150 bp。

反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火45 s；熔解曲線生成反應體系95℃1 min，55℃1 min；55℃10 s（80個循環(huán)）。計算出每份樣品中目的基因進行PCR擴增時達到閾值時的Ct，并通過內參基因β-肌動蛋白校正，計算公式：ΔCt＝Ct－同基因所有樣本中間值，基因的表達量＝2－ΔΔCt，相對定量＝目的基因表達量／內參基因的表達量，組內基因表達量采用均數(shù)±標準誤（ˉx±SE）表示。

1.4.5 免疫組化法檢測血管中MCPIP、MCP-1、NF-κB的表達 血管組織經(jīng)10%甲醛固定24 h，石蠟包埋切片（厚度4μm），切片在37℃烘箱中放置24 h后采用SABC法進行免疫組化染色。用PBS稀釋一抗，稀釋比為1∶100；另用PBS取代一抗作為陰性對照。光學顯微鏡觀察免疫組化結果，拍照記錄。用IPP 6.0軟件分析組織中表達蛋白的積分光密度值（integral optical density，IOD），統(tǒng)計結果用均數(shù)±標準差（±s）表示。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠胸主動脈組織的大體形態(tài)

正常對照組大鼠胸主動脈血管壁光滑，無增厚、硬化和斑塊，無病變跡象；模型組血管出現(xiàn)萎縮、硬化，血管壁增厚，有多處鈣化斑塊；模型給藥組血管壁增厚、硬化，能見少量鈣化斑塊；正常給藥組血管無病變跡象。見圖1。

圖1 動脈粥樣硬化大鼠胸主動脈組織大體觀察

2.2 大鼠胸主動脈病理學檢查結果

見圖2。正常對照組動脈壁薄厚均勻，內膜光滑，無增厚，中膜平滑肌細胞排列整齊，外膜結締組織無明顯變化；模型組動脈內皮細胞脫落，大部分血管嚴重萎縮、鈣化，出現(xiàn)大量硬化斑塊，血管壁結構層次不清晰；模型給藥組部分血管肌層萎縮、鈣化，有硬化斑塊，血管壁結構層次不清晰；正常給藥組動脈壁薄厚均勻，內膜光滑，無增厚。

圖2 動脈粥樣硬化大鼠胸主動脈HE染色結果

2.3 SIF對As大鼠胸主動脈MCP-1、CCR2、MCPIP和CRPmRNA表達量的影響

實時定量PCR檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型組MCP-1，CCR2，MCPIP和CRP mRNA表達顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，模型給藥組的各基因表達均有明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。正常給藥組的各基因表達與正常對照組比較無明顯差異。見表1。

表1 動脈粥樣硬化大鼠胸主動脈MCP-1、CCR2、MCPIP和CRPm RNA表達量 ˉx±SE

2.4 免疫組化法檢測As大鼠胸主動脈中MCP-1、MCPIP、NF-κB蛋白的表達

400倍鏡下免疫組化結果顯示（圖3，表2），模型組胸主動脈中的MCP-1、MCPIP和NF-κB 3種蛋白表達量均比正常對照組明顯增多（P＜0.01）；而模型給藥組3種蛋白表達量比模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常對照組與正常給藥組的各蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；

3 討論

MCP-1屬于趨化因子CC亞家族，MCP-1與CCR2結合后，能激活并誘導單核細胞在動脈血管壁上聚集，形成泡沫細胞。MCP-1還可誘導血管內皮細胞凋亡及平滑肌細胞增殖［8－9］，是導致As的一個重要因素。MCP-1的表達隨動脈粥樣硬化程度增加而增加，抑制MCP-1表達或封閉MCP-1／CCR2通路能減少血管損傷或粥樣硬化導致的小鼠內膜增生［9］，因此，針對MCP-1的干預措施有可能降低心血管疾病的危險性。

圖3 免疫組化檢測大鼠胸主動脈中MCP-1、MCPIP和NF-κB蛋白的表達（SABC法×400）

表2 SIF對大鼠胸主動脈MCP-1、MCPIP、NF-κB蛋白表達量的影響±s，n＝5，IOD×10－3

表2 SIF對大鼠胸主動脈MCP-1、MCPIP、NF-κB蛋白表達量的影響±s，n＝5，IOD×10－3

a：P＜0.01，與正常對照組比較；d：P＜0.05，與模型組比較

組別 MCP-1 MCPIP NF-κB正常對照組22.36±2.33 18.28±5.64 50.46±10.79模型組 107.84±25.08a 106.36±11.93a 156.52±23.37a模型給藥組 56.54±18.11d 75.94±12.1d 99.86±6.91d正常給藥組 30.14±6.50 21.16±4.37 50.38±5.38 F值29.699 107.667 69.025 P值0.000 0.000 0.000

MCPIP是Kalattukudy P.E小組2006年在探討MCP-1在心血管疾病中的作用時發(fā)現(xiàn)的一個具有轉錄活性的鋅指蛋白。該研究組在用MCP-1作用于人外周血單核細胞后，該蛋白被誘導表達，因此將其命名為單核細胞趨化蛋白-1誘導蛋白［10］。2010年 Qin等［11］報道，在高脂喂飼的ApoE－／－As模型鼠主動脈中MCPIPmRNA表達量比野生型鼠增加了2.5倍；在人As斑塊組織中MCPIP表達也顯著增加。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)MCP-1與CCR2結合后，通過NF-κB信號通路誘導MCPIP的表達，MCPIP發(fā)揮其轉錄激活和（或）RNA酶活性參與動脈粥樣硬化等多種病理過程［12－14］。

CRP主要在肝臟合成，近年來的研究表明，在人As活動期進展斑塊內也能產(chǎn)生CRP，且這些局部產(chǎn)生的CRP是As時血清CRP升高的重要來源。CRP不僅可作為心血管疾病的一種標志，其本身還可作為介質通過多種機制促進As發(fā)生發(fā)展［5］。

本實驗的結果顯示，與正常組比較，模型組MCP-1、CCR2、MCPIP、CRP基因轉錄活性明顯增加，MCP-1、MCPIP及調控兩者表達的轉錄因子NF-κB蛋白表達增強，結果與既往報道一致，進一步證實了這幾個炎性分子參與了As發(fā)生發(fā)展過程。

從大體和病理觀察的結果看，模型給藥組大鼠血管粥樣硬化病變較模型組明顯減輕，進一步證實SIF可抑制As病變的形成。在模型給藥組中，實驗所檢測的幾個炎性分子mRNA轉錄量都較模型組明顯減少，說明SIF可以抑制這幾個炎性基因的表達，提示SIF抑制大鼠血管動脈粥樣硬化病變形成與降低炎癥分子的表達有密切關系。近期研究發(fā)現(xiàn)［15－16］，MCPIP除由MCP-1誘導表達外，還能被IL-1β、TNF-α誘導，而且IL-6、IL-1和TNF-α也是誘導CRP的主要因子。MCP-1、IL-1β、TNF-α及IL-6的表達均受NF-κB的調控，免疫組化的結果發(fā)現(xiàn)，SIF抑制了NF-κB的激活，提示SIF可能是通過抑制NF-κB激活進而下調MCP-1及其他炎性分子表達，從而進一步減少了CRP和MCPIP的表達。

本實驗設置了正常給藥組與正常組比較，正常給藥組血管大體觀及病理檢查均無改變，各炎性基因的表達差異無統(tǒng)計學意義，表明SIF對于正常血管中炎性基因的表達沒有顯著性的影響，也沒有發(fā)現(xiàn)其會對血管造成損害。

綜上所述，SIF能夠抑制大鼠As病變的形成，其機制可能與SIF抑制NF-κB的活化，下調促As病變的炎癥相關基因MCP-1、CCR2、MCPIP及CRP的表達有關。本研究從新的角度報道了SIF抗As的作用機制，為已投入市場的大豆異黃酮心血管保護作用提供了新的實驗依據(jù)。

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Effect of soy isoflavones on the expression of inflammatory molecules gene in atherosclerosis rats

LUO Jie1，QIN Xu1，WEIYu2，QIAN Min-zhang1
（1.Department of Biological Chemistry，ZunyiMedical College，Zunyi Guizhou 563003；2.Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College，ZunyiGuizhou 563003，China）

Objective：To investigate the effects of soy isoflavones（SIF）on the expression of gene for proinflammatory of atherosclerosis（As）in the As rats.M ethods：To establish the ratsmodel of As，were randomly divided into normal control，model，model＋SIF and normal＋SIF group；the pathological changes of thoracic aorta of rats in each group were observed by HE staining；Real time-PCR and immunohistochemical detection of the expression of gene for proinflammatory of As in vessels.Results：Themodel group showed severe atrophy and calcification of thoracic aorta compared with normal control group，even appear atherosclerotic plaques；compared with model group，model＋SIF group showed actions in lessening the atherosclerosis lesion obviously；both normal control group and normal＋SIF group without pathological changes of thoracic aorta.Compared with model group，mRNA level of MCP-1／CCR2，MCPIP and CRP were higher than that in normal control group of thoracic aorta（P＜0.01 or P＜0.05）；mRNA level of the four genes inmodel＋SIF group of thoracic aortawere lower than that inmodel group；there was not significant difference in mRNA level of the four genes between normal control group and normal＋SIF group.Immunohistochemistry results showed thatexpression of positive staining and range ofMCPIP，MCP-1，and NF-κB in model group were higher than in normal control group（P＜0.01），the expression of positive staining and range of the three protein in model＋SIF group were lower than in model group（P＜0.05）.Between the normal control group and the normal＋SIF group，the expression of positive staining and range of the three protein were no significant difference.Conclusion：SIF can obviously decrease the expression of genes related to proinflammatory of As，and inhibit the atherosclerosis formation in rats.

atherosclerosis；soybean isoflavones；MCP-1／CCR2；MCPIP；CRP；NF-κB

R543.1

A

1671－7783（2014）02－0099－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y130283

book=104,ebook=17

遵義醫(yī)學院2012年招標課題（F－613）

羅潔（1986—），女，碩士研究生；錢民章（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：qian＿mzh＠hotmail.com

2014－01－03 ［編輯］何承志