靶向miR-126慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及意義

楊學(xué)藝，盧小東，邵啟祥，劉家秀，劉娟

（1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校檢驗(yàn)藥學(xué)系，江蘇淮安223300；3.淮安市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇淮安223001）

靶向miR-126慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及意義

楊學(xué)藝1，2，盧小東1，邵啟祥1，劉家秀2，劉娟3

（1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校檢驗(yàn)藥學(xué)系，江蘇淮安223300；3.淮安市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇淮安223001）

目的：檢測(cè)微小RNA-126（microRNA-126，miR-126）在CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）中的表達(dá)水平，同時(shí)構(gòu)建基于慢病毒的miR-126反義寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides，ASOs）表達(dá)載體。方法：實(shí)時(shí)定量PCR特異性探針?lè)z測(cè)miR-126在Tregs中的表達(dá)水平；針對(duì)miR-126序列，設(shè)計(jì)合成其ASOs序列，退火后連接至經(jīng)AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶雙酶切的pGCsil-LV-GFP載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的載體（命名為pGCsil-miR-126-ASOs）進(jìn)行測(cè)序分析；將構(gòu)建成功的pGCsil-miR-126-ASOs表達(dá)質(zhì)粒和pHelper 1.0、pHelper 2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，濃縮病毒顆粒并測(cè)定所獲病毒滴度；將制備好的病毒顆粒感染經(jīng)TGF-β體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠CD4＋CD62L＋初始T細(xì)胞，72 h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其Foxp3的表達(dá)變化。結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示miR-126在CD4＋CD25＋Tregs中的表達(dá)明顯高于CD4＋CD25－T細(xì)胞（P＜0.01）；測(cè)序結(jié)果證明成功構(gòu)建pGCsil-miR-126-ASOs重組質(zhì)粒載體，包裝并獲得高濃度的慢病毒顆粒，病毒滴度為9×108TU／m L；重組的病毒能明顯抑制Tregs的外周誘導(dǎo)（P＜0.05）。結(jié)論：成功構(gòu)建miR-126 ASOs的慢病毒表達(dá)載體，并獲得高濃度的病毒顆粒。

微小RNA-126；CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；反義寡核苷酸；慢病毒

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一組內(nèi)源性、長(zhǎng)度在22～24 nt的非編碼單鏈小RNA分子，能在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)促進(jìn)靶mRNA的降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯來(lái)負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能［1－2］。近年來(lái)大量研究顯示，T細(xì)胞亞群具有不同的miRNAs表達(dá)譜，后者在不同亞群T細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能維持中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用［3－4］。

CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Tregs）是一群具有負(fù)向免疫調(diào)控抑制功能的CD4＋T細(xì)胞亞群，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)定的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其與其他亞群之間的失衡常常導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸、免疫耐受的打破和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展［5］。外周血中的Tregs分為胸腺發(fā)育產(chǎn)生的nTregs（natural Tregs）和經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTregs（induced Tregs）兩類(lèi)。體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTregs在臨床疾病如感染性疾病和腫瘤等發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，然而其誘導(dǎo)機(jī)制仍不明確。新近的研究表明，miRNAs與Tregs的發(fā)育和功能密切相關(guān)［6］。因此，分析特定的miRNAs分子與Tregs之間的關(guān)系將有助于揭示Tregs在外周微環(huán)境中被誘導(dǎo)的機(jī)制。

miR-126是近年來(lái)報(bào)道的miRNAs家族成員之一，在包括腫瘤在內(nèi)的多種臨床疾病發(fā)生中發(fā)揮了重要作用［7］。新近的研究顯示，miR-126對(duì)于CD4＋T細(xì)胞的功能起了關(guān)鍵的調(diào)控作用［8］，然而，還未有報(bào)道其是否參與Tregs的外周誘導(dǎo)過(guò)程的研究。本研究擬先檢測(cè)Tregs中miR-126的表達(dá)水平，然后構(gòu)建基于慢病毒的miR-126反義寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides，ASOs）表達(dá)載體，并初步觀察miR-126 ASOs是否影響Tregs的外周誘導(dǎo)，以期為后續(xù)深入探討特定miRNAs分子在Tregs外周誘導(dǎo)過(guò)程中的作用及機(jī)制提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

慢病毒載體系統(tǒng)包括pGCsil-LV-GFP載體、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體（GeneChem公司）；AgeⅠ、Eco RⅠ、T4DNA連接酶（美國(guó)NEB公司）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞（本室保存），質(zhì)粒抽提試劑盒（美國(guó)Promega公司），瓊脂糖凝膠回收試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（北京索萊寶科技公司），鼠Tregs、CD4＋CD62L＋初始T細(xì)胞磁珠分選試劑盒（美國(guó)Miltenyi Biontec公司），PCR試劑（TaKaRa公司），LipofectamineTM2000（美國(guó)Invitrogen公司），流式抗體（eBioscience公司），LightCycler定量PCR儀（Roche公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），Gel DocTMXR＋凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-126的表達(dá)

MACS磁珠法分選BALB／c小鼠脾臟Tregs和CD4＋CD25－T（conventional T cell，Tcon）細(xì)胞，Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；用miR-126特異性發(fā)夾狀引物按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作應(yīng)用LightCycler定量PCR儀對(duì)兩群細(xì)胞miR-126成熟體進(jìn)行定量檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。在擴(kuò)增結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%凝膠電泳分析，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和靈敏度。miR-126成熟體目的基因相對(duì)表達(dá)水平＝特異基因的DNA含量／內(nèi)參GAPDH的含量。

1.3 靶向miR-126 RNA反義寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)和合成

通過(guò)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)到miR-126（MIMAT0000137）序列為5′-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3′，設(shè)計(jì)相應(yīng)的反義寡核苷酸序列，正義鏈：CCGGCGCGTACCAAAAGTAATAATGTTTTTG；反義鏈：AATTCAAAAACATTATTACTTTTGGTACGCG；上下游序列分別含有AgeⅠ和Eco RⅠ酶切位點(diǎn)。將合成的正義鏈、反義鏈溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15 min，自然冷卻進(jìn)行退火反應(yīng)形成雙鏈的DNA插入片段。

1.4 重組慢病毒載體的構(gòu)建

將退火形成的雙鏈DNA插入片段和經(jīng)AgeⅠ和Eco RⅠ酶切后線性化的pGCsil-LV-GFP質(zhì)粒在T4DNA連接酶作用下于16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化氯化鈣法新鮮制備的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布在氨芐西林抗性的LB培養(yǎng)平皿，培養(yǎng)12 h，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的克隆送美季生物公司測(cè)序分析；菌落PCR及測(cè)序引物由捷瑞生物公司合成，上游：5′-GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC-3′；下游：5′-AATTCAAAAACATTATTACTTTTGGTACGCG-3′。將構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pGCsil-miR-126-ASOs。

1.5 慢病毒顆粒的制備

調(diào)整293T細(xì)胞密度為1.2×107／mL，接種于20 cm培養(yǎng)皿，37℃，5%CO2全濕度培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)，將pGCsil-miR-126-ASOs、pHelper 1.0、pHelper 2.0 3種質(zhì)粒利用LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，8 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集上清液，于4℃，4000×g離心10 min，懸液用0.45μm濾器過(guò)濾，進(jìn)行濃縮處理后于－80℃保存。

1.6 有限稀釋法測(cè)定病毒滴度

將100μL 293T細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔4×104個(gè)，37℃、5%CO2全濕度培養(yǎng)36 h后進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。取8個(gè)無(wú)菌EP管，編為1～8號(hào)，每管中加90μL的Opti-MEM，1號(hào)管加10μL病毒顆粒，混勻后吸取10μL加入2號(hào)管混勻，依次倍比稀釋至8號(hào)管，選擇對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)孔，吸取90μL培養(yǎng)液，加入對(duì)應(yīng)稀釋的病毒顆粒90μL，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，更換為100μL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，根據(jù)表達(dá)GFP的293T細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算病毒滴度。

1.7 感染CD4＋CD62L＋初始T細(xì)胞

MACS磁珠法分選CD4＋CD62L＋初始T細(xì)胞，用CD3e（2 mg／mL）抗體包被培養(yǎng)板，合并可溶性CD28抗體（2 mg／mL）、IL-2（100 U／mL）、TGF-β（10 ng／mL），在含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 mg／mL鏈霉素、1 mmol／L L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，按MOI＝100加入相應(yīng)體積的miR-126ASOs慢病毒顆粒，37℃、5%CO2全濕度培養(yǎng)12 h，更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)60 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Foxp3的表達(dá)，同時(shí)設(shè)立3個(gè)對(duì)照組：PBS組、pGCsil-對(duì)照組、TGF-β組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Tregs中miR-126的表達(dá)

實(shí)時(shí)PCR特異性探針?lè)z測(cè)Tregs和CD4＋CD25－T細(xì)胞中miR-126成熟體的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-126在Tregs中的表達(dá)水平明顯高于CD4＋CD25－T細(xì)胞（t＝2.93，P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Tregs和CD4＋CD25－T細(xì)胞m iR-126的表達(dá)Fig 1 Real-time PCR analysis of expression ofm iR-126 inTregs and CD4＋CD25－T cells

2.2 pGCsil-LV-GFP載體的線性化

對(duì)pGCsil-LV-GFP載體用限制性?xún)?nèi)切酶AgeⅠ和Eco RⅠ進(jìn)行雙酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，酶切片段大小應(yīng)為7 352 bp，結(jié)果顯示酶切片段大小正確（圖2）。

圖2 pGCsil-LV-GFP載體的線性化Fig 2 Enzyme cutting production of pGCsil-LV-GFP vector

2.3 重組質(zhì)粒pGCsil-miR-126-ASOs的鑒定

線性化的pGCsil-LV-GFP載體和miR-126 ASOs插入片段的連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑選出陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌液PCR。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，8個(gè)克隆中只有2號(hào)克隆為陰性，其余克隆均為陽(yáng)性，且產(chǎn)物大小正確（274 bp）（圖3）。篩選出的陽(yáng)性克隆經(jīng)搖菌、抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，與設(shè)計(jì)序列完全一致（圖4），結(jié)果表明成功構(gòu)建pGCsil-miR-126-ASOs重組質(zhì)粒。

圖3 陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig 3 Agarose gel electrophoresis of the positive clone PCR product

圖4 重組質(zhì)粒pGCsil-m iR-126-ASOs的DNA序列Fig 4 DNA sequencing analysis of the recombinant plasm id pGCsil-m iR126-ASOs

2.4 慢病毒顆粒的包裝及滴度

將pGCsil-miR-126-ASOs、pHelper 1.0和pHelper 2.0這3種質(zhì)粒體外共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后，逐步收集培養(yǎng)上清。濃縮慢病毒顆粒后，采用有限稀釋法感染293T細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)GFP的表達(dá)（圖5），計(jì)數(shù)各培養(yǎng)孔表達(dá)GFP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算得到病毒的滴度為9×108TU／mL。

圖5 pGCsil-m iR-126-ASOs慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞后GFP的表達(dá)（×100）Fig 5 Expression of GFP in 293T cells infected by pGCsilm iR-126-ASOs lentivirus

2.5 miR-126 ASOs對(duì)Tregs的外周誘導(dǎo)的抑制

按文獻(xiàn)［9］報(bào)道建立Tregs的體外誘導(dǎo)體系，將表達(dá)pGCsil-miR-126-ASOs的慢病毒顆粒加入培養(yǎng)體系中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Foxp3的表達(dá)。結(jié)果顯示PBS組、pGCsil-對(duì)照組、TGF-β組和pGCsil-miR-126-ASOs組中CD4＋T細(xì)胞的Foxp3表達(dá)比例分別為（0.93±2.02）%、（5.94± 0.02）%、（6.01±0.04）%、（1.55±0.02）%。分析發(fā)現(xiàn)，與TGF-β組比較，pGCsil對(duì)照對(duì)Tregs的外周誘導(dǎo)未產(chǎn)生明顯影響（t＝1.48，P＞0.05），而pGCsil-miR-126-ASOs Foxp3組的相對(duì)比率明顯降低（t＝97.5，P＜0.001），見(jiàn)圖6。

圖6 m iR-126-ASOs對(duì)Tregs外周誘導(dǎo)的影響Fig 6 Effects ofm iR-126-ASOs on the peripheral induction of Foxp3

3 討論

Tregs是能抑制免疫系統(tǒng)激活的獨(dú)特T細(xì)胞功能亞群，在維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)和自身耐受中具有重要的作用。目前認(rèn)為T(mén)regs主要包括從胸腺T細(xì)胞發(fā)育分化而來(lái)的nTreg和在特定的外周微環(huán)境中，由成熟CD4＋CD25－T細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)生成的iTreg［10］。大量研究顯示，iTreg在腫瘤免疫、黏膜免疫耐受和過(guò)敏性反應(yīng)中均具有重要的作用［11］。因此，Tregs的外周誘導(dǎo)機(jī)制引起了研究者們的廣泛關(guān)注。已有的研究顯示，TGF-β-Smad信號(hào)途徑在Tregs的外周誘導(dǎo)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［12－13］。然而，在TGF-β誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)過(guò)程中，如果PI3K-Akt信號(hào)途徑的磷酸化水平升高，則會(huì)抑制Foxp3的誘導(dǎo)表達(dá)，相反，提前抑制PI3K-Akt信號(hào)途徑的傳遞，則可上調(diào)Foxp3的表達(dá)［14－15］。由此可見(jiàn)，PI3K-Akt信號(hào)途徑在Tregs的外周誘導(dǎo)中也具有重要的調(diào)控作用。此外，還有研究顯示IL-2或CD28分子信號(hào)途徑也參與了Tregs的外周誘導(dǎo)過(guò)程［16－17］。然而，這些與Tregs外周誘導(dǎo)密切相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)途徑的調(diào)控分子至今仍未闡明。

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示多種miRNAs分子參與了Tregs的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)［6］。Cobb等［18］發(fā)現(xiàn)在Dicer－／－小鼠體內(nèi)，Tregs的數(shù)量和功能明顯降低。Jiang等［19］的研究也發(fā)現(xiàn)miR-17和miR-19b通過(guò)作用于靶基因TGFβ-RⅡ、CREB1和PTEN調(diào)節(jié)Tregs的誘導(dǎo)分化過(guò)程。這些研究表明，特定的miRNAs在Tregs的外周誘導(dǎo)和功能發(fā)揮中起了關(guān)鍵的調(diào)控作用。然而，由于miRNAs分子家族成員的龐大和Tregs外周誘導(dǎo)機(jī)制的復(fù)雜性，只有深入研究特定miRNAs分子參與調(diào)控Tregs外周誘導(dǎo)的作用及機(jī)制才能為T(mén)regs外周誘導(dǎo)機(jī)制的闡明提供幫助。

miR-126是新近報(bào)道的miRNAs家族成員，位于鼠的2號(hào)染色體EGFL7基因7號(hào)內(nèi)含子［7］。大量研究顯示，miR-126在機(jī)體多種組織發(fā)育和臨床疾病如腫瘤發(fā)生中起了關(guān)鍵的調(diào)控作用。新近的研究［8］還發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4＋T細(xì)胞高表達(dá)miR-126，后者通過(guò)作用于靶分子Dnmt1調(diào)控CD4＋T細(xì)胞的功能。更重要的是，miR-126是PI3K-Akt信號(hào)途徑傳遞的重要調(diào)節(jié)分子［20］。鑒于PI3K-Akt的信號(hào)途徑在Tregs外周誘導(dǎo)中的重要性，我們首先通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Tregs中miR-126的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Tregs中miR-126的表達(dá)水平明顯高于CD4＋CD25－T細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，特定的miRNAs在T細(xì)胞的不同亞群中的差異表達(dá)對(duì)于T細(xì)胞的發(fā)育或功能具有重要意義。Zhou等［21］研究顯示miR-150在胸腺T細(xì)胞的CD4－CD8－雙陰性階段低表達(dá)，在CD4＋CD8＋雙陽(yáng)性階段和CD8＋T細(xì)胞中適度表達(dá)，而在CD4＋T細(xì)胞中則高表達(dá)，提示miR-150的這種動(dòng)態(tài)的變化可能對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育具有調(diào)控作用。Curtale等［22］發(fā)現(xiàn)，miR-146a在初始T細(xì)胞中低表達(dá)，而在記憶性T細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)初始T細(xì)胞在TCR信號(hào)刺激下，能誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá)，期間需要NF-κB和c-ETS的結(jié)合位點(diǎn)參與。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)miR-146a能影響除炎癥外的多種信號(hào)通路，能作為抗凋亡因子調(diào)控活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡并作用于Fas相關(guān)死亡域蛋白，上調(diào)miR-146a的表達(dá)能削弱TCR刺激引起的AP-1（activator protein 1）和IL-2的產(chǎn)生。此外，微陣列技術(shù)分析表明，bic／miR-155缺失的小鼠CD4＋T細(xì)胞表現(xiàn)出Th2偏向的分化，進(jìn)一步研究顯示小鼠的c-Maf和Itk表達(dá)升高，而c-Maf和Itk是Th2細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子，這可能是miR-155缺失小鼠出現(xiàn)Th2分化偏向的原因之一［23］。因此，我們推測(cè)miR-126可能參與了Tregs外周誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)過(guò)程。

作為抑制目的基因表達(dá)的手段之一，反義核酸技術(shù)也是研究miRNAs功能的有效工具，該技術(shù)是通過(guò)結(jié)合特異miRNAs，阻止其與靶基因的結(jié)合，抑制后者功能的發(fā)揮［24］。為進(jìn)一步探討miR-126是否參與Tregs的外周誘導(dǎo)過(guò)程，我們通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建了基于慢病毒的miR-126 ASOs表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果表明載體構(gòu)建成功。我們進(jìn)一步將miR-126 ASOs表達(dá)載體和pHelper 1.0、pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，將病毒收集濃縮后，通過(guò)有限稀釋法測(cè)定其滴度為9×108TU／mL。然后，我們將病毒加入Tregs的體外誘導(dǎo)體系中，結(jié)果顯示，當(dāng)miR-126被特異性ASOs抑制后，Tregs的外周誘導(dǎo)比例明顯降低。我們推測(cè)該效應(yīng)可能與miR-126被抑制后，增強(qiáng)了PI3K-Akt信號(hào)途徑的傳遞，從而削弱了Tregs的誘導(dǎo)。然而，其具體的分子機(jī)制仍待后續(xù)研究闡明。

總之，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Tregs高表達(dá)miR-126。更重要的是，通過(guò)構(gòu)建的miR-126 ASOs慢病毒表達(dá)載體，我們發(fā)現(xiàn)，抑制miR-126可以有效地削弱Tregs的誘導(dǎo)，提示miR-126可能在Tregs外周誘導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。

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Construction of a lentiviral vectors of antisense oligonucleotide targeting on them iR-126 and its signficance

YANG Xue-yi1，2，LU Xiao-dong1，SHAO Qi-xiang1，LIU Jia-xiu2，LIU Juan3

（1.Department of School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Departmentof Laboratory＆Pharmacy，Huaiyin Advanced Vocational＆Technical School Of Health，Huai′an Jiangsu 223300；3.Departmentof Laboratory Medicine，the Forth People′s Hospital of Huai′an，Huai′an Jiangsu 223002，China）

Objective：To evaluate the expression of miR-126 in human peripheral blood CD4＋CD25＋regulatory T cells（Tregs），construct a lentiviral vector of antisense oligonucleotides（ASOs）againstmiR-126.M ethods：The expression level ofmiR-126 in Tregs and CD4＋CD25－T cellswas determined by real-time PCR respectively.The ASOs againstmiR-126 were synthesized and inserted into the pGCsil-LV-GFP plasmid and constructed the pGCsil-miR-126-ASOs plasmid which was indentified by RT-PCR and DNA sequencing.Additional，pHelper 1.0，pHelper 2.0 and pGCsil-miR-126-ASOs vectors were cotransfected into 293T cells by LipofectamineTM2000.After 48 h cultrue，the supernatantwas harvested and the titer of pGCsil-miR-126-ASOs lentivirus was determined by limiting dilution analysis.Finally，CD4＋CD62L＋na?ve T cellswere infected with pGCsil-miR-126-ASOs lentivirus at MOI（multiplicity of infection）＝100 and cultured in the presence of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody plus IL-2 and TGF-βfor another 72 h，the expression of Foxp3 was analyzed by flow cytometry.Results：The expression level ofmiR-126 in Tregswas significantly higher than CD4＋CD25－T cells（P＜0.01）.Furthermore，themiR-126 ASOs inhibited the induction of Tregs in vitro（P＜0.05）.Conclusion：The lentiviral vector ofmiR-126 ASOswas constructed successfully and laid the foundation for the further re- search on themiR-126 ASOs in regulation of Treg functions.

miR-126；CD4＋CD25＋regulatory T cells；antisense oligonucleotides；lentiviral vector

R392.1

A

1671－7783（2014）01－0012－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y130116

楊學(xué)藝（1980—），男，碩士研究生；邵啟祥（通訊作者），教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：shao-qx＠m(xù)ail.ujs.edu.cn

2013－05－31 ［編輯］陳海林