反相離子對HPLC法同時測定鹽酸二甲雙胍中雙氰胺和三聚氰胺的含量

王麗娟,劉軍英,劉惠濤

(煙臺大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 煙臺 264005)

鹽酸二甲雙胍(Metformin Hydrochloride)又名1,1-二甲基雙胍鹽酸鹽,為雙胍類口服降血糖藥,治療非胰島素依賴型糖尿病[1]，主要作用于胰島外組織,抑制腸吸收葡萄糖[2]．雙氰胺(Cyanoguanidine,CGD)和三聚氰胺(Melamine,MEL)都是鹽酸二甲雙胍的合成中間體(圖 1),毒性較大,必須嚴格控制其在藥品中的含量,保證患者用藥安全、有效，目前規(guī)定其限量分別為0.02%和0.1%[3]．

雙氰胺和三聚氰胺的檢測方法包括氣相色譜[4]、高效液相色譜[3,5-10]、薄層層析[11]、毛細管電泳[12-13]和表面增強拉曼散射光譜法[14]等．但采用簡單的反相HPLC法同時測定鹽酸二甲雙胍中的雙氰胺和三聚氰胺含量的方法還未見報道．本文使用C18反相色譜柱,通過對離子對試劑的種類、配比、pH值等因素的系統(tǒng)考察,建立一種測定鹽酸二甲雙胍制劑中的雜質(zhì)雙氰胺和三聚氰胺的離子對色譜法．

圖1 雙氰胺和三聚氰胺的結(jié)構(gòu)式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1525型高效液相色譜儀,配有Waters 2487型紫外檢測器,美國Waters 公司;pH/Lon 510型酸度計,新加坡Crison公司,型號pH 5500,精度0.01個pH單位;雙光束紫外可見分光光度計,型號TU-1901,北京普析通用儀器有限公司;超聲波清洗儀,型號SK3300HP,上?？茖?dǎo)超聲有限公司;分析天平,型號AL-204,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司．

雙氰胺對照品(中國食品藥品檢定研究院),三聚氰胺對照品(Dr. Ehrenstorfer股份有限公司(德國)),庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、乙腈、甲醇均為色譜純,檸檬酸為分析純,鹽酸二甲雙胍片2批,樣品① 批號:H11021518,樣品② 批號:H20060614．實驗用水均為超純水．

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18反相色譜柱 (5 μm; 250×4.6 mm);流動相:乙腈-離子對試劑水溶液(10 mmol/L戊烷磺酸鈉+10 mmol/L檸檬酸,pH值為3.0，體積比10∶90);流速:1.0 mL/min;檢測波長:217 nm;進樣量:20 μL;柱溫:25 ℃．

1.2.2 溶液的制備 雙氰胺對照品溶液:取雙氰胺對照品約5 mg,精密稱定,置5 mL容量瓶中,加入流動相溶解并稀釋至刻度,得雙氰胺對照品儲備液．

三聚氰胺對照品溶液:取三聚氰胺對照品約5 mg,精密稱定,置10 mL容量瓶中,加入流動相溶解并稀釋至刻度,得三聚氰胺對照品儲備液．

混合標準溶液:分別精密量取雙氰胺對照品儲備液和三聚氰胺對照品儲備液各1.0 mL,置100 mL容量瓶中,加入流動相溶解并稀釋至刻度,制成每1 mL中約含雙氰胺10 μg和三聚氰胺5 μg的混合標準溶液．

供試品溶液:取鹽酸二甲雙胍片樣品① 、②各3片,精密稱定,研細,精密稱取適量(約相當于鹽酸二甲雙胍500 mg),置100 mL容量瓶中,加超純水20 mL,超聲處理15 min后流動相稀釋至刻度,搖勻,過濾．所用溶液分析前均經(jīng)0.45 μm濾膜過濾．

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的確定 經(jīng)過紫外雙光束分光光度計掃描(190～400 nm),得到雙氰胺的最大吸收波長是217 nm,三聚氰胺的最大吸收波長是204 nm．而國標中三聚氰胺的檢測波長為240 nm,因此分別測定217 nm和240 nm波長下的色譜,離子對試劑為戊烷磺酸鈉,對乙腈的體積比為90∶10,試驗濃度為10 mmol/L(含10 mmol/L檸檬酸,pH值為3.0),結(jié)果顯示在240 nm下CGD 和MLN的吸收峰均較弱,因此選擇217 nm為2種物質(zhì)的最佳檢測波長．

2.1.2 離子對試劑種類的選擇 選用的離子對試劑為戊烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉,試驗濃度為10 mmol/L(含10 mmol/L檸檬酸,pH值為3.0),對乙腈的體積比為90∶10．結(jié)果顯示,使用戊烷磺酸鈉最為離子對試劑的保留時間更短,且分離良好．綜合考慮溶劑峰與雙氰胺峰的分離度以及保留時間的差異,最終選擇戊烷磺酸鈉作為離子對試劑．

2.1.3 離子對試劑pH值的選擇 以戊烷磺酸鈉為離子對試劑,濃度為10 mmol/L,與乙腈體積比為90∶10,分別考察了pH值為2.5、3.0、3.5、4.0不同條件下的分離情況．結(jié)果顯示,在不同pH值條件下,雙氰胺的保留時間均變化不顯著,而三聚氰胺的保留時間隨pH值增大而延長,pH值為2.5和4.0時雙氰胺與溶劑峰不能分離,當流動相pH值為3.0時雙氰胺和三聚氰胺具有最佳分離和最短分析時間,因此選擇離子對試劑溶液的pH值為3.0．

2.1.4 流動相比例的選擇 采用10 mmol/L的戊烷磺酸鈉(pH值為3.0),分別考察了流動相中離子對試劑與乙腈的體積比為85∶15、90∶10、95∶5的不同實驗條件下,雙氰胺和三聚氰胺的分離度．結(jié)果顯示,流動相比例為90∶10時雙氰胺和三聚氰胺具有最佳分離,因此選擇流動相的比例為90∶10．

綜上所述,最優(yōu)分離條件為乙腈-離子對試劑水溶液(10 mmol/L戊烷磺酸鈉+10 mmol/L檸檬酸,pH值為3.0，體積比10∶90)．

2.2 方法驗證

2.2.1 線性 分別配制雙氰胺和三聚氰胺一系列不同濃度的混合標準溶液,在最優(yōu)色譜條件下進行測定,以峰面積對組分濃度分別作圖,在0.02～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)得到雙氰胺回歸方程為A雙氰胺=229 028c雙氰胺+528.24,R=0.999 9;在0.02～50 μg/mL濃度范圍內(nèi),三聚氰胺回歸方程是A三聚氰胺=159 033c三聚氰胺+16 650,R=0.999 9．表明在試驗濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性良好．

2.2.2 檢出限和定量限 取對照品溶液稀釋到合適濃度,進樣,以信噪比的3倍和10倍計算檢出限和定量限．雙氰胺的檢出限為4.0 ng/mL,定量限為15.0 ng/mL;三聚氰胺的檢出限為6.0 ng/mL,定量限為20.0 ng/mL．

2.2.3 精密度 取2種物質(zhì)的標準品溶液日內(nèi)和日間連續(xù)進樣5次,計算日內(nèi)精密度和日間精密度,結(jié)果如表1所示．

2.3 樣品測定

在上述優(yōu)化的色譜條件下,對鹽酸二甲雙胍片中的三聚氰胺和雙氰胺的雜質(zhì)含量進行測定,結(jié)果如圖2中b、c所示．2種批號的藥品中均未檢出三聚氰胺和雙氰胺．

表1 HPLC測定CGD和MLN的精密度(n=5)

圖2 空白、標準、樣品及樣品加標色譜圖

2.4 回收率

在2種樣品中加入已知濃度的2種標準物質(zhì),按照樣品處理步驟處理樣品后進樣．根據(jù)色譜圖峰面積計算2種物質(zhì)的回收率,結(jié)果如表2所示．從表中可以看出,雙氰胺的平均回收率是97.6%,三聚氰胺的平均回收率是96.5%．說明HPLC法測定樣品中雙氰胺和三聚氰胺回收率良好．

3 方法討論

雙氰胺和三聚氰胺均為極性化合物,很難在常用的C18柱上保留．因此,文獻中測定鹽酸二甲雙胍藥品中的雙氰胺和三聚氰胺所使用的方法為親水相互作用色譜法(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography,HILIC)．但此方法需要使用價格較為昂貴的特定色譜柱．而本研究中使用常見的ODS C18反相色譜柱,加入離子對試劑,2種雜質(zhì)在5 min內(nèi)分離完全,保留時間更短,且檢出限和定量限均低于上述方法,是一種簡單經(jīng)濟的有效測定方法．

4 結(jié) 論

本研究建立了一種高效快速的HPLC方法同時測定鹽酸二甲雙胍藥品中的雙氰胺和三聚氰胺,2種雜質(zhì)在5 min內(nèi)分離完全．該方法分離效率高,分析時間短,靈敏度好,樣品處理簡單快速,是鹽酸二甲雙胍藥品中雜質(zhì)檢測的一種有效方法．

表2 樣品中CGD和MLN的回收率的測定(n=3)

注：—為未檢出.

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