Gasbench Ⅱ-IRMS測(cè)定新鮮橙汁水中氧同位素方法

徐勝，鐘其頂，王道兵

（1.農(nóng)夫山泉股份有限公司，浙江杭州310007；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；3.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京100027）

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21731-2008《橙汁及橙汁飲料》雖然明確規(guī)定了非復(fù)原橙汁和復(fù)原橙汁的定義，尚未建立非復(fù)原橙汁和復(fù)原橙汁的有效鑒別配套技術(shù)方法。國(guó)際上通常采用橙汁中水的氧（18O/16O，記作δ18O）同位素比值作為NFC橙汁真實(shí)性鑒別特征指標(biāo)[1-6]。如歐洲果蔬汁協(xié)會(huì)（AIJN）采用橙汁中水的δ18O值作為NFC橙汁和FC橙汁鑒別指標(biāo)，其中美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）和歐盟委員會(huì)（CEN）先后制訂了測(cè)定（濃縮）橙汁水中δ18O的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)牛麗影和鐘其頂?shù)热顺醪教接懥怂笑?8O在國(guó)內(nèi)NFC橙汁真實(shí)性識(shí)別中的應(yīng)用，研究表明NFC橙汁水中δ18O明顯區(qū)別于復(fù)原橙汁[7-8]。

目前，AOAC和CEN等測(cè)定橙汁水中δ18O的標(biāo)準(zhǔn)方法主要采用離線二氧化碳-水平衡法[9]，但該分析方法不僅存在樣品量大，勞動(dòng)強(qiáng)度大，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的要求高等特點(diǎn)，且無法實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)進(jìn)樣，分析效率低，難以滿足大規(guī)模連續(xù)測(cè)定。在線二氧化碳-水平衡系統(tǒng)在近年來得到快速發(fā)展，Debajyoti Paul和Grzegorz Skrzypek研究了不同因素對(duì)GasBench-IRMS測(cè)定二氧化碳中δ18O時(shí)穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性的影響，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化[10]；孫青等人應(yīng)用GasBench II-IRMS分析天然水樣中δ18O，穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性均比較理想[11]；張琳等人對(duì)離線水平衡-雙路進(jìn)樣法和GasBench IIIRMS進(jìn)行了比較，結(jié)果表明兩種方法測(cè)定水中δ18O的精密度和準(zhǔn)確度基本一致，均能得到較好的分析數(shù)據(jù)[12]。本文通過優(yōu)化方法參數(shù)，建立GasBench-IRMS測(cè)定橙汁中（尤其是新鮮橙汁）水的δ18O方法，探討在大規(guī)模連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定橙汁中水的δ18O在線分析系統(tǒng)。

1 材料方法

1.1 儀器和主要試劑

GasBenchII前處理裝置配備：GCPAL自動(dòng)進(jìn)樣器，PoraPlotQ色譜柱（25m×0.32mm），恒溫樣品盤（溫度精度±0.1℃），硼硅酸鹽反應(yīng)瓶（12mL），進(jìn)樣針和吹氣針。

檢測(cè)器為Delta V advantage（美國(guó)Thermo Finnigan公司），儀器控制軟件為ISODATE 3.0。

高純He、CO2標(biāo)準(zhǔn)氣和0.3%CO2+He混合氣，銅絲，活性碳粉末，乙醇（色譜純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

新鮮橙子采自安遠(yuǎn)養(yǎng)生堂臍橙種植基地，去皮后榨汁，用三層紗布過濾后待測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

設(shè)定恒溫樣品盤溫度27℃，He壓力為80 kPa。在樣品瓶中加入銅絲和活性炭，加入樣品后放入恒溫樣品盤。固定進(jìn)樣針和吹氣針，設(shè)定自動(dòng)進(jìn)樣器程序，充0.3%的CO2+He混合氣10 min，帶走瓶中的空氣。設(shè)定樣品充氣與樣品分析之間的間隔，使氣體CO2與水中氧發(fā)生同位素交換[13]。用質(zhì)譜儀測(cè)定平衡后的CO2同位素比值。

1.4 結(jié)果表示

采用相對(duì)測(cè)量法表示物品中18O/16O，結(jié)果以δ（千分差，‰）表示

式中：R樣品為樣品中18O與16O的比值；R標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)VSMOW中18O與16O比值，18O/16O=（2 005.20±0.43）×10-6。

1.5 數(shù)據(jù)校正

樣品測(cè)定過程中插入質(zhì)控水樣和標(biāo)準(zhǔn)水樣，依據(jù)Stephen等[14]報(bào)道的VSMOW/SLAP校正法進(jìn)行校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 參考?xì)夥治鼍?/h3>

連續(xù)流-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定時(shí)，參考?xì)夥治鼍鹊暮脡闹苯佑绊憳悠返姆治鼍群蜏?zhǔn)確度。對(duì)于水中氧同位素分析，控制二氧化碳參考?xì)馔凰胤治鰞?nèi)精度至關(guān)重要。連續(xù)10次通入?yún)⒖細(xì)猓瑴y(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ）＜0.015‰（見表1）；改變參考?xì)膺M(jìn)樣量（以信號(hào)強(qiáng)度表示），測(cè)定值的變化率為-0.035‰/V（見表2）。表1和表2數(shù)據(jù)表明儀器的內(nèi)精度符合測(cè)定要求，而CO2的進(jìn)樣量在1 V～10 V變化時(shí)，δ18O分析結(jié)果不受影響。

系統(tǒng)內(nèi)精度數(shù)據(jù)見表1，信號(hào)強(qiáng)度對(duì)δ18O的影響見表2。

表1 IRMS系統(tǒng)內(nèi)精度δ18O（‰）Table 1 Inter-precision for δ18O analysis

表2 δ18O（‰）與信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系Table 2 Influence of intensities on the determination of δ18O

2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)穩(wěn)定性

樣品瓶?jī)?nèi)氣體由進(jìn)樣針導(dǎo)入GasBench，CO2經(jīng)色譜柱分離純化后由八通閥導(dǎo)入IRMS中，連續(xù)進(jìn)樣10次，測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差1-σ＜0.08‰（見表3），滿足同位素測(cè)定要求。

GasBench II-IRMS測(cè)定δ18O的進(jìn)樣穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表3。

表3 進(jìn)樣系統(tǒng)穩(wěn)定性δ18O（‰）Table 3 Inlet system stability for δ18O analysis

2.3 影響因素分析

2.3.1 樣品瓶氣密性

文獻(xiàn)[10]報(bào)道超過24 h時(shí)瓶?jī)?nèi)CO2中δ18O呈現(xiàn)偏重趨勢(shì)，即反應(yīng)瓶氣密性變化導(dǎo)致瓶?jī)?nèi)氣體滲漏繼而出現(xiàn)同位素分餾。本實(shí)驗(yàn)表明52 h之內(nèi)CO2中δ18O值恒定（見圖1），這說明本研究所選擇的反應(yīng)瓶能夠保證至少52 h內(nèi)不出現(xiàn)同位素分餾。

測(cè)定時(shí)間對(duì)δ18O的影響見圖1。

圖1 反應(yīng)瓶氣密性驗(yàn)證Fig.1 Gastight test of vial

2.3.2 樣品體積的影響

孫青的研究表明樣品水體積對(duì)δ18O的分析結(jié)果有明顯干擾，當(dāng)樣品水量較大時(shí)，測(cè)量值受體積的影響較小，而樣品水量較小時(shí)，測(cè)量值受體積的影響較大[11]。本研究分別向樣品瓶中加入0.2、0.5、1 mL橙汁樣品，結(jié)果（見表4）表明不同體積的橙汁樣品對(duì)水中δ18O的分析結(jié)果沒有明顯干擾，即由于橙汁樣品水中氧的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過平衡物質(zhì)CO2物質(zhì)的量，平衡體系中CO2的初始同位素比值對(duì)分析結(jié)果沒有影響。

樣品體積對(duì)δ18O的影響見表4。

表4 樣品體積對(duì)水中δ18O（‰）測(cè)定的影響Table 4 Influence of sample volume on δ18O determination

2.3.3 平衡時(shí)間的選擇

CO2/He混合氣與水發(fā)生氧同位素交換，分別在12、16、20、24、32、40、48、72 h 時(shí)測(cè)定，反應(yīng)時(shí)間在12 h～24 h時(shí)測(cè)得的氧同位素值比較偏負(fù)，且呈現(xiàn)逐漸偏正的趨勢(shì)，這表明水與CO2還未完全達(dá)到同位素平衡；反應(yīng)24 h～72 h時(shí)測(cè)得的結(jié)果比較接近（見圖2）。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄酒水中δ18O的影響Fig.2 Influence of equilibrium time on δ18O determination

2.3.4 乙醇及發(fā)酵對(duì)橙汁水中δ18O測(cè)定的影響

GasBench-IRMS的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在于可不間斷測(cè)定大量樣品，由于同位素交換反應(yīng)和樣品測(cè)定間隔的緣故，樣品在反應(yīng)瓶中等待最少24 h、最多48 h才能進(jìn)行測(cè)定，在此過程中橙汁（尤其是鮮橙汁）存在發(fā)酵的可能，然而發(fā)酵產(chǎn)生的CO2會(huì)嚴(yán)重影響水中δ18O的測(cè)定[15]。為研究橙汁自然發(fā)酵對(duì)測(cè)定的影響，分別對(duì)橙汁樣品按表5進(jìn)行處理。

果汁發(fā)酵產(chǎn)生的CO2對(duì)δ18O的影響見表5。

表5 發(fā)酵對(duì)水中δ18O測(cè)定的影響Table 5 Influence of fermentation on the determination of δ18O

結(jié)果表明A組（反應(yīng)瓶?jī)?nèi)有橙汁和CO2-He混合氣）中CO2的信號(hào)強(qiáng)度明顯增加，但增加的程度不同，這可能是由于待測(cè)過程中的先后順序不同導(dǎo)致反應(yīng)瓶?jī)?nèi)樣品的發(fā)酵程度有差異；B中加入了乙醇，CO2的含量相對(duì)穩(wěn)定且信號(hào)強(qiáng)度僅有9.5 V；向C和D中加入相同質(zhì)量的酵母，另向C中加入乙醇，由表5可知D中CO2的信號(hào)強(qiáng)度明顯大于50 V，超過了IRMS的測(cè)定線性范圍；相對(duì)D，C中CO2信號(hào)強(qiáng)度顯著降低，僅比B高一點(diǎn)，這說明乙醇抑制酵母發(fā)酵的作用顯著。

為驗(yàn)證乙醇對(duì)δ18O測(cè)定的影響，配制體積分?jǐn)?shù)為0、5%、10%、15%、20%的乙醇水溶液，測(cè)定其水中δ18O（見表6），結(jié)果乙醇濃度在0%～20%范圍內(nèi)時(shí)不影響水中δ18O的測(cè)定穩(wěn)定性及結(jié)果準(zhǔn)確性，因此可選用乙醇作為橙汁水中δ18O測(cè)定過程中的發(fā)酵抑制劑。

乙醇濃度對(duì)水中δ18O測(cè)定的影響見表6。

表6 乙醇溶液中的水中δ18OTable 6 δ18O-value of water in ethanol-water solution

2.4 方法穩(wěn)定性

采用IRMS與GasBench II聯(lián)用，利用CO2-H2O平衡在線連續(xù)分析新鮮橙汁中氧穩(wěn)定同位素組成，方法為：恒溫樣品盤溫度為27℃，He壓力80 kPa，0.5 mL橙汁樣品中加入活性碳、銅絲和0.05 mL乙醇后與0.3%CO2+He混合氣與平衡24 h～48 h，用質(zhì)譜儀測(cè)定同位素交換平衡后CO2中δ18O，用標(biāo)準(zhǔn)水樣校正測(cè)定結(jié)果。

2.4.1 精密度

對(duì)同一橙汁樣品重復(fù)測(cè)定5次（見表7），橙汁水中δ18O的1-σ＜0.1‰。

GasBench II-IRMS測(cè)定果汁水中δ18O的精密度。

表7 水中δ18O（‰）精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The precision of δ18O-value analysis of water in juices

2.4.2 再現(xiàn)性

選擇同一橙汁樣品每隔一周測(cè)定一次（見表8），1-σ＜0.1‰。

GasBench II-IRMS測(cè)定果汁水中δ18O的再現(xiàn)性結(jié)果見表8。

表8 水中δ18O（‰）再現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Reproducibility of δ18O-value of water in juices

由此可知，本法測(cè)定新鮮橙汁水中δ18O的精密度與再現(xiàn)性指標(biāo)均比較理想，符合樣品水中δ18O測(cè)定的要求。

3 結(jié)論

本研究建立了GasBench II-IRMS測(cè)定橙汁氧同位素組成的在線分析方法：應(yīng)用GasBench II設(shè)備對(duì)樣品進(jìn)行水-CO2平衡，通過加入乙醇可有效抑制待測(cè)過程中果汁發(fā)酵，最后用IRMS測(cè)定CO2中δ18O并計(jì)算得出樣品水中δ18O。該法測(cè)定精密度和穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定性高，相對(duì)于其他方法操作簡(jiǎn)便、分析快速，適合果汁行業(yè)和檢測(cè)系統(tǒng)的大規(guī)模樣品測(cè)定，為我國(guó)建立NFC果汁技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系提供科學(xué)方法支撐。

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