微波輔助浸提馬齒莧活性成分的工藝

秦愛麗，沈君琪，陳凌，童孟新，邵華，李鑫偉

（嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與環(huán)境分院，浙江嘉興314036）

馬齒莧（Porlulaca oleracea L.）屬馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本植物，具有抗菌、降血脂、抗衰老、松弛肌肉、抗炎、鎮(zhèn)痛以及促進(jìn)傷口愈合等功效[1-6]。馬齒莧既可入藥，又可食用，是我國衛(wèi)生部劃定的78種藥食同源的野生植物之一。國外許多學(xué)者研究了馬齒莧的抗菌作用[7-12]，國內(nèi)也有不少學(xué)者對馬齒莧提取物的研究表明它具有殺菌作用，如用馬齒莧煎煮液，口服治療急性胃腸道感染性疾病不僅對致病菌有直接殺傷作用，而且直接補(bǔ)充和糾正了因嘔吐和腹瀉所引起的胃腸液大量丟失及酸堿失衡[13]；馬齒莧水煎劑體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對6種常見致病菌有明顯的抑菌作用[14]等。國際上，食品添加劑的發(fā)展趨向是天然、營養(yǎng)和功能化方面發(fā)展，而馬齒莧提取物符合這些條件，它有可能成為一種天然無毒的多功能食品防腐劑。本文采用微波輔助熱水浸提、乙醇浸提法提取馬齒莧活性成分，用正交試驗(yàn)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期尋找最佳提取工藝條件，為該珍貴野生植物資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生馬齒莧，采于嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)，經(jīng)嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院陳玉琴副教授鑒定。將新鮮馬齒莧全草洗凈，晾至表面無水分，于80℃恒溫干燥，取出后粉碎，石油醚脫脂，35℃烘干備用。95%酒精、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸氫鈉均為分析純：上海聯(lián)試化工試劑有限公司；蘆丁、沒食子酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Folin-Ciocalteu試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市英峪高科儀器廠；DK-S24型恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；722分光光度計(jì)：上海海爭電子科技有限公司；賽多利斯電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；格蘭仕G80W23CSL-A6K微波爐：廣東格蘭仕集團(tuán)公司；202-2A數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠；Smartpark DQ3純水柱，D-Q-3超純水儀等。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

單因素實(shí)驗(yàn)：馬齒莧粉→加溶劑微波輔助浸提→離心分離→上清液→濃縮→冷凍干燥→稱重。

正交試驗(yàn)：馬齒莧粉→加溶劑微波輔助浸提→離心分離→上清液→濃縮→定容→測含量。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

影響馬齒莧活性成分提取率的主要因素有提取劑、提取溫度、浸提時(shí)間、固液比和提取次數(shù)等。本實(shí)驗(yàn)稱取馬齒莧粉3.000 g，置于三角瓶中，按料液比（干粉重量∶溶劑，g/mL）1∶30按以下步驟加入溶劑提取。各水平試驗(yàn)3次取平均值。

1）提取溶劑的選擇：馬齒莧粉分別加入純水、60%酒精、95%酒精，放入微波爐中，在功率350 W條件下提取2 min后，于40℃的水浴中浸提30 min。濃縮提取液，冷凍干燥，稱重。

2）水浴浸提溫度的選擇：馬齒莧粉加入純水，放入微波爐中，在功率350 W條件下提取2 min后，分別置于40、50、70℃的水浴中浸提1 h。濃縮提取液，冷凍干燥，稱重。

3）水浴浸提時(shí)間的選擇：馬齒莧粉加入純水，放入微波爐中，在功率350 W條件下提取2 min后，分別置于50℃的水浴中浸提30 min、1 h和2 h。濃縮提取液，冷凍干燥，稱重。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、微波時(shí)間、微波功率和浸提次數(shù)作為考察因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化馬齒莧活性成分的提取工藝條件。

1.4 活性成分含量測定

馬齒莧活性成分含量的測定主要測其葡萄糖、酚類、黃酮的含量，測定方法如下：

1）采用苯酚一硫酸法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，分光光度計(jì)測定其多糖含量；

2）采用Folin-Ciocalteu方法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，比色法測定其總酚的含量；

3）采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法，以蘆丁為對照品，分光光度計(jì)測定馬齒莧黃酮的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對提取率的影響

浸提溶劑對提取率的影響見表1。

表1 浸提溶劑對提取率的影響Table 1 Extraction solvents on extraction rate

由表1可知，提取溶劑為95%酒精時(shí)的提取率最高，但與水浸提相差不是很大，考慮到提取成本，選用純水作為提取溶劑。95%酒精的提取率最高，這與活性成分主要是有機(jī)物有關(guān)，根據(jù)相似相溶原理有機(jī)物易溶于有機(jī)溶劑；而60%酒精的提取率最低，是因?yàn)榇颂崛┲兴c酒精形成氫鍵，而使浸提液與馬齒莧活性成分的作用力減弱，使其提取率降于純水。

2.1.2 浸提溫度對提取率的影響

浸提溫度對提取率的影響見表2。

表2 浸提溫度對提取率的影響Table 2 Extraction temperature on the extraction rate influence

由表2可知，提取劑為水時(shí)浸提溫度為70℃時(shí)提取率最高，50℃時(shí)最低。升高溫度，滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快，有利于活性成分轉(zhuǎn)移至水中，提取率隨之提高；但溫度升高，揮發(fā)性成分也隨著揮發(fā)，使提取率降低，50℃時(shí)提取率最低說明此溫度下?lián)]發(fā)性活性成分揮發(fā)。雖然70℃提取率明顯高于40℃的提取率，但考慮到能耗，選用40℃作為浸提溫度。

2.1.3 浸提時(shí)間對提取率的影響

浸提時(shí)間對提取率的影響見表3。

表3 浸提時(shí)間對提取率的影響Table 3 Extraction time on extraction rate influence

從表3可見，50℃時(shí)水浸提，浸提時(shí)間120 min的得率最高，但與30 min時(shí)的相差很小，60 min時(shí)提提取率最低?？紤]到效率問題，選用30 min浸提時(shí)間。時(shí)間過短，活性成分還未充分溶出，但當(dāng)時(shí)間過長，活性成分的溶出量變化不大，這是由于提取時(shí)間過長，提取液內(nèi)有效成分濃度已達(dá)到平衡。再者揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)量增加，反而使提取率降低。

單因子實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：用純水作為提取劑，在40℃浸提30 min為最佳選擇。

2.2 正交試驗(yàn)分析

2.2.1 正交試驗(yàn)

稱取馬齒莧1.000 g，用純水在40℃浸提30 min，活性成分以多糖、酚類、黃酮提取率的總和為考察指標(biāo)，選定4個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 多糖提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal of polysaccharides extraction

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案因素水平表L9（34）Table 5 Table of factors level of design plan

從表5可以看出，用純水浸提馬齒莧活性成分，各因素對活性成分得率的影響大小順序?yàn)椋毫弦罕龋疚⒉〞r(shí)間＞浸提次數(shù)＞微波功率，即A＞C＞D＞B。由于微波功率對浸提效果的影響最小，考慮到能耗，選擇350 W。綜合分析得出最佳工藝條件為：料液比1∶50、微波1 min、浸提1次、微波功率350 W。

2.2.2 提取液中活性成分的含量

2.2.2.1 多糖含量

精密稱取105℃干燥恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2 g，用蒸餾水溶解至100 mL容量瓶中定容，吸取5 mL此溶液再定容于100 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL 分別置于比色管中，加蒸餾水使體積為1.0mL，再加入體積分?jǐn)?shù)6%的苯酚溶液1mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置至室溫，用分光光度法于490 nm處測定吸光度A，以糖濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是：A=0.560 7c+0.040 0，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。

分別取正交試驗(yàn)的9種浸提液，按作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣步驟測其吸光度，將A帶入回歸方程求得多糖濃度（c），然后計(jì)算出多糖得率（見表5）。

2.2.2.2 黃酮的含量

精密稱取蘆丁對照品200 mg，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解，定容到100 mL容量瓶中，搖勻，精密吸取10 mL，置于100 mL容量瓶中，用水定容，得到0.2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管準(zhǔn)確吸取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10 mL的比色管中，加入水1 mL，加入5%亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，放置 6 min，加入10%硝酸鋁 0.4 mL，搖勻，放置6 min，加入4.3%氫氧化鈉4.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以試劑空白為參比，用分光光度計(jì)在500 nm處測定吸光度（A），以蘆丁濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：A=0.944 6c+0.017，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 5。

同樣分別取正交試驗(yàn)的9種浸提液，按作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣步驟測其吸光度，帶入回歸方程求得蘆丁濃度（c），然后計(jì)算出黃酮得率（見表5）。

2.2.2.3 酚類的含量測定

取沒食子酸0.2 g，蒸餾水溶解，且迅速定容到100 mL的容量瓶內(nèi)，得2.0 mg/mL沒食子酸溶液。在從中移取10 mL沒食子酸溶液于100 mL容量瓶內(nèi)，并加入蒸餾水，定容到100 mL，作為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，迅速加入0.6mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，3 min后加入10%Na2CO3溶液1.5 mL，加入蒸餾水定容到10 mL。30℃避光反應(yīng)2 h，在750 nm處測定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：A=8.580 8c+0.274 6，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 1。

取上述九種浸提液1 mL于比色管內(nèi)，同上述步驟測其吸光度，同理計(jì)算出酚類得率（見表5）。由表5可知：馬齒莧的水提物的主要成分是多糖，黃酮的含量很少，酚類的含量更少。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)最佳工藝參數(shù)料液比1∶50、微波1 min、浸提1次、微波功率350 W，做3次平行試驗(yàn)，活性成分提取率分別為32.6%、33.1%和32.8%，平均得率為32.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.982%，重現(xiàn)性較好，因此此提取工藝條件為最佳選擇。

3 結(jié)論

1）以馬齒莧活性成分中多糖、酚類、黃酮提取率的總和為指標(biāo)，結(jié)合單因素及正交實(shí)驗(yàn)確定馬齒莧活性成分提取率的各因素影響順序：料液比＞微波時(shí)間＞浸提次數(shù)＞微波功率。

2）綜合分析得出最佳工藝條件為：以純水為溶劑，料液比1∶50，微波時(shí)間1 min，浸提1次，微波功率350 W，浸提時(shí)間30 min，浸提溫度40℃。在此條件下多糖的含量比黃酮和酚類高得多，酚類含量最少，活性成分提取率可達(dá)33.0%。

3）用水作浸提劑馬齒莧的活性成分主要是多糖。

4）工藝簡單，可操作性強(qiáng)，提取率高，所用水成本低和安全性高，所獲得的提取液濃縮物可用于功能食品、營養(yǎng)食品的原料。

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