高密度二氧化碳殺菌蛋白液貯藏期間微生物和理化功能性質(zhì)變化

劉文營

（國家蛋品工程技術研究中心，北京102115）

對蛋白液的殺菌方式通常采用的是巴氏殺菌，巴氏殺菌對食源性致病菌具有良好的殺滅效果，但是高溫殺菌處理常常會影響食品的營養(yǎng)價值、感官品質(zhì)和功能性質(zhì)，特別是在較低溫度下就會發(fā)生變性的物料，因此，非熱殺菌技術得到越來越廣泛的研究和應用。

高密度二氧化碳技術（DensePhaseCarbonDioxide，DPCD）是一種新型的冷殺菌技術，其在食品加工過程中可最大限度的保留食品中的有益成分，是一種綠色潔凈技術。其利用二氧化碳的化學惰性、無腐蝕性、高揮發(fā)性、獨特的經(jīng)濟性和在高壓條件下具有的殺菌作用[1-2]，來對物質(zhì)在相對較低溫度下進行殺菌或鈍酶，可以最大限度地保持食品營養(yǎng)、風味和新鮮度等品質(zhì)[3-8]，且不會影響食品安全性。

在對DPCD對微生物的作用效果研究時，Spilimbergo[9]、Murat[10]和 Liao[11]等的實驗結(jié)果均顯示，所采用的處理壓力越大，對微生物的鈍化、致死能力越強。本文設計了一組實驗，分別對蛋白液進行不同的壓力和時間的處理，然后在4℃條件下貯藏，對1到4周貯藏期間蛋白液的微生物增殖和理化功能性質(zhì)的變化進行了分析。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

分離當天鮮蛋蛋白液后用勻漿器勻漿，然后分成10組，每組5份樣品，一組為空白對照，將處理后的蛋白液貯藏在4℃層析柜，處理條件見表1。

表1 不同殺菌處理條件Table 1 Different sterilization conditions

CO2（純度：99.5%，北京千禧京城氣體有限公司）；Tris、Glycine、DTNB、EDTA（Amresco，美國）；ANS、Urea（Sigma，美國）；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

F6/10-10G超細勻漿器：上海FLUKO流體機械制造有限公司；WBN-5/50型DPCD殺菌機：溫州貝諾機械有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；YT-GJ-2ND型超凈工作臺：北京亞泰科隆儀器技術有限公司；SL-Ⅲ層析柜：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；XYF2-40-H型純水機：北京湘順源科技有限公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計：SHIMADZU，JAPAN；Eclipse spectrofluorimeter熒光可見分光光度計：美國Cary公司；萬分之一電子天平：梅特勒公司；PH211臺式酸度計：意大利哈納科儀公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白液高密度二氧化碳處理

首先，開啟冷卻器和恒溫水浴使其達到設定溫度；之后，開啟水浴循環(huán)使處理釜達到30℃，將樣品放進處理釜后密封，然后開啟增壓泵泵入CO2，待溫度和壓力達到預設條件后維持相應時間，處理條件完成后卸壓取出樣品。

1.3.2 微生物計數(shù)

參考國標進行微生物平板菌落計數(shù)[12-14]。將菌液用0.85%生理鹽水以10倍稀釋法進行逐級稀釋，根據(jù)細菌數(shù)量選擇合適的稀釋度進行逐級稀釋，吸取連續(xù)3個不同稀釋度的稀釋樣1.0 mL于滅菌平皿中，倒入約15 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或者選擇性培養(yǎng)基，搖勻后分別于30℃（大腸桿菌）、37℃（沙門氏菌、菌落總數(shù)）下培養(yǎng)48 h后計數(shù)。每個稀釋度做三個平行。

式中：T 為 2.303；D 為稀釋倍數(shù)，100；c為蛋白質(zhì)的濃度，0.2%；φ為油相所占的體積分數(shù)，25%。1.3.5 pH的測定

pH計經(jīng)7.01和10.01的標準液校準后，直接進行pH測定。

1.3.6 表面疏水性

采用熒光探針ANS法[17]。用10 mmol/L的緩沖溶液（pH 7.0）配制不同濃度的蛋白溶液（0.005%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%和0.2%）和8 mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8naphthalene-sulfonate，ANS）溶液。檢測前取20 μL ANS溶液加到4 mL蛋白質(zhì)溶液中，混合均勻，迅速測定混合液的熒光強度（Fl’）及未加ANS溶液的樣品熒光強度（FI0）。激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm。Fl’與FI0的差值記為Fl，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，F(xiàn)l為縱坐標作圖，曲線的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)H0。

1.3.7 自由巰基含量

方法[18]，蛋白溶液與Tris-Gly緩沖液（0.086 molTris，0.09 mol/L Gly，0.04 mol/L EDTA，8 mol/L

式中：N為樣品中菌落總數(shù)，CFU/mL；∑C為平板菌落數(shù)之和；n1為第一稀釋度平板個數(shù)；n2為第二稀釋度平板個數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

1.3.3 起泡能力變化

參考文獻方法[15]，并進行了修改。取4 mL蛋白液，加入蒸餾水定容至50 mL（H0），倒入250 mL燒杯中，于超細勻漿器上以104r/min的轉(zhuǎn)速每隔30 s攪拌均質(zhì)1次，均質(zhì)4次后，快速轉(zhuǎn)移至50 mL量筒，記下液體高度（H1）。蛋白溶液起泡能力大小的評價用泡沫高度即（H0-H1）表示，每個樣品做3次重復。

1.3.4 乳化能力變化

參考文獻中的方法進行乳化性能（emulsifying activity index，EAI）的測定[16]。

將各樣品用緩沖溶液配制成終濃度為0.2%的蛋白樣品，取2 mL色拉油與6 mL待測溶液混合，然后104g均質(zhì)1 min，然后立即從底部取50 μL，用含有0.1%的SDS的緩沖溶液稀釋成5 mL，震蕩后立即測500 nm下的吸光值A0。Urea）混合，10 000 g離心10 min，取上清液測游離巰基（SHF）含量。

游離巰基（SHF）含量：取2 mL上清液加入80 μL Ellman's試劑（4 mg/mL，DTNB（5，5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）），立即混勻，5 min后在λ=412 nm下測吸光度值（A412）。

巰基的計算公式如下：

式中：73.53=106/（1.36×104），1.36×104是Ellman's試劑的摩爾消光系數(shù)；A412為λ=412 nm下吸光度值；C為樣品的蛋白質(zhì)濃度，（mg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間微生物數(shù)量變化

對9組處理的樣品和未處理原樣進行大腸桿菌和沙門氏菌的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，均無菌落生成。

對蛋白液在貯藏期間的微生物數(shù)量的變化比較，結(jié)果如圖1所示。

圖1 貯藏期間微生物數(shù)量變化圖Fig.1 Microbial quantity variation during storage

單獨進行同一時間殺菌效果分析時，結(jié)果顯示高密度二氧化碳對微生物具有致死作用，且在10 MPa時，隨著處理時間的延長，微生物數(shù)量減少的越多，其他處理均沒有或者只有很少數(shù)量的微生物存在。隨著貯藏時間的延長，微生物數(shù)量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，10 MPa，10 min條件處理下，微生物數(shù)量最多，增加的趨勢也最快。

單獨考慮殺菌處理對微生物的致死作用時，Spilimbergo[9]、Murat[10]和 Liao[11]等的結(jié)果均顯示，壓力越大，對微生物的鈍化、致死能力越強，與本實驗結(jié)果具有一致性。

2.2 pH的變化

DPCD處理時通入大量的CO2，在物料內(nèi)形成高壓高酸的環(huán)境，來達到致死、鈍化微生物的目的。殺菌處理后的蛋液的pH會有一定的降低，一方面是高壓高酸處理導致的蛋白溶液基質(zhì)的變化，另一方面是殘留的CO2，其中后者占主要地位。DPCD對蛋白液的pH的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 貯藏期間蛋白液pH變化圖Fig.2 Protein liquid pH variation during storage

在對物料進行處理時，由于在處理過程中，二氧化碳大量滲入到液體中，使得液體酸度降低，處理結(jié)束后泄壓的時間和速度不同，殘留的二氧化碳也不同，這也就是結(jié)果中pH的規(guī)律性不強的原因，隨著貯藏時間的延長，殘留CO2的減少，殺菌處理對蛋白液的性質(zhì)的影響減弱，蛋白液的pH逐漸增加，到第4周時達到和初始的pH相當?shù)乃健?/p>

當用DPCD處理蘋果汁等其它物料時，結(jié)果也顯示物料酸度會降低[11]。

2.3 疏水性

圖3 貯藏期間蛋液疏水性變化圖Fig.3 Egg white protein hydrophobic variation during storage

蛋白質(zhì)氨基酸殘基的疏水性是影響蛋白質(zhì)溶解性、結(jié)構(gòu)和結(jié)合脂肪能力的一個重要因素。蛋白質(zhì)的疏水自由能也是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要因素。由圖3可知，高密度二氧化碳處理后蛋白液的疏水性明顯降低，且在貯藏期間疏水性指數(shù)隨著時間的延長而增加。9組處理樣品的疏水性指數(shù)在不同貯藏期，基本保持在一個相似大小的水平上。第4周和第3周的疏水性指數(shù)基本一致，說明從第3周開始蛋白的疏水性指數(shù)變化不大。

疏水性受蛋白體系的酸堿度影響，蛋白液是一個復雜的體系，二氧化碳處理使得酸堿度降低，且不同處理蛋白具有不同的表觀形態(tài)，也就使得疏水性呈現(xiàn)相對不規(guī)律的變化，但在貯藏期間內(nèi)呈現(xiàn)增加的趨勢。

2.4 表面巰基含量

表面巰基是親水性巰基，一般情況下表面巰基含量與疏水性的變化趨勢大致呈現(xiàn)相反的趨勢，而當高密度二氧化碳處理時，促使了蛋白液蛋白性質(zhì)發(fā)生了變化，包括溶解性增加、可溶性蛋白含量增加等，使得蛋白液在疏水性強度增加的情況下巰基含量也增加。表面巰基含量表達的是分子間作用力的變化，與凝膠強度相關。

表面巰基的變化如圖4所示。

圖4 貯藏期間蛋白表面巰基含量變化圖Fig.4 Egg white protein surface sulfhydryl content variation during storage

第1周數(shù)據(jù)顯示在10 MPa壓強下呈現(xiàn)降低的趨勢，20 MPa和30 MPa條件下，均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，與同等時期蛋白疏水性降低后增高的趨勢相反。在后期貯藏期間，隨著時間的延長，二氧化碳的散失，指數(shù)基本保持在相似的水平上，整體差異不大。

貝君等[19]利用高密度二氧化碳處理脂肪酶時，結(jié)果顯示脂肪酶的巰基含量隨著處理壓力的增加而增加，與本實驗結(jié)果具差異性?？赡転榈鞍滓汉椭久傅臓顟B(tài)不一樣，影響了高密度二氧化碳的處理效果，但均具有處理后巰基含量增加的現(xiàn)象。

2.5 處理前后蛋白液的乳化活性變化

蛋白液貯藏期間乳化性的變化如圖5所示。

圖5 貯藏期間蛋液乳化性變化圖Fig.5 Egg white emulsification variation during storage

經(jīng)過不同條件處理的蛋白液乳化性呈現(xiàn)不同的趨勢，整體與未經(jīng)處理的蛋液差異較大。第1周結(jié)果顯示，在10 MPa壓力處理下，乳化性隨著處理時間的增加乳化活性下降，而在20 MPa和30 MPa條件下，則隨著時間的延長，乳化性呈現(xiàn)增加的趨勢，第2周的數(shù)據(jù)基本保持第1周的趨勢，但整體乳化性增強，從第2周開始，乳化性的變化趨勢開始變緩，逐漸向同一水平靠攏，趨于增加。蛋白液蛋白的乳化性指數(shù)大小是蛋白整體乳化活性的反映，同蛋白液的疏水性和巰基含量變化的趨勢相似。

結(jié)果說明處理壓力和貯藏時間均影響蛋液的乳化性，且乳化性隨著貯藏時間的延長而變化，液體內(nèi)殘留二氧化碳的不同可能也會導致乳化活性的不同和影響蛋液乳化性的規(guī)律性變化。

2.6 蛋白液的起泡能力變化

圖6 貯藏期間蛋白液的起泡能力質(zhì)變化圖Fig.6 Egg white foaming capacity variation during storage

圖6 中蛋白液的起泡能力變化結(jié)果顯示，單獨考慮某一時期蛋白液的起泡能力變化時，蛋液的起泡能力與表面巰基的含量變化趨勢相反，和表面疏水性的變化趨勢相似，蛋白質(zhì)的起泡能力也和表面巰基有一定的關系[20-21]。

蛋白液的起泡能力隨著時間的延長整體呈現(xiàn)增加的趨勢，且在第4周時明顯表現(xiàn)出，隨著同一壓力下，隨著處理時間的延長蛋白質(zhì)的起泡能力減弱，處理壓力增加起泡能力也減小。

3 結(jié)論

隨著貯藏時間的延長，在初始微生物總數(shù)的基礎上，微生物數(shù)量呈現(xiàn)不同程度的增加，到第4周時，1到4號樣品均檢測到微生物生長，5到9號樣品則沒有檢測到微生物。

在貯藏期間內(nèi)，蛋白液中殘留二氧化碳的釋放，使得蛋白液的pH呈現(xiàn)增加的趨勢，到第4周時，基本恢復到處理之前的數(shù)值大小。疏水性指數(shù)變大和表面巰基含量先增加后降低，都是趨于恢復到初始大小的趨勢。

10 MPa壓力處理蛋白溶液的乳化性，隨著時間的延長呈現(xiàn)整體降低的趨勢，20 MPa壓力處理的蛋液的乳化性基本保持不變，30 MPa壓力處理蛋液的乳化性增加，整體呈現(xiàn)隨著壓力和處理時間的延長乳化性變強的趨勢；蛋白液的起泡能力隨著貯藏時間的延長而增加，第4周時，表現(xiàn)為隨著處理壓力和時間的增加起泡能力降低的趨勢。

針對高密度二氧化碳處理影響蛋白液功能性的機理和影響方式，至今還不清晰，尚需更深入的研究。同時，在進行高密度二氧化碳處理樣品的制備上還需進一步完善，以降低二氧化碳殘留對量等對結(jié)果有影響的因素的影響。

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