半仿生提取柿葉黃酮及其抗氧化和抗菌作用

孫彩云，柳鑫華，王慶輝，李媛媛，張飛龍

（河北聯(lián)合大學輕工學院，河北唐山063000）

柿葉是柿屬植物柿的葉片，柿子在我國各地普遍栽培，約40多種，京津唐地區(qū)以磨盤柿聞名。柿果、柿蒂、柿花、柿葉、柿根皮均可入藥。柿葉味苦、性寒，作為藥用始載于明代《滇南本草》[1]?！侗静菰傩隆酚涊d柿葉可“治咳嗽吐血，止渴生津”。20世紀80年代起柿葉茶風靡日本，他們認為常飲柿葉茶，對高血壓、腦溢血、糖尿病的防治有較好療效。柿葉在印度傳統(tǒng)醫(yī)藥中也被廣泛應(yīng)用。柿葉中含有葉綠素、黃酮、VC、β-胡蘿卜素、生物堿、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)[2-3]，黃酮是其主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗突變、抗腫瘤等多種作用。半仿生提取法[4]是為經(jīng)消化道的中藥試劑設(shè)計的一種提取工藝，即模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運的原理，采用不同pH的酸性水和堿性水依次連續(xù)提取，其目的是盡可能地提取和保留原藥中的有效成分。從柿葉提取黃酮可變廢為寶，提高其開發(fā)利用價值。

1 材料與方法

1.1 原料

磨盤柿葉（采集于河北遵化，干燥、粉碎，過40目篩備用）。

1.2 儀器及試劑

主要儀器：752紫外-可見分光光度計（杭州）；HH-8恒溫數(shù)顯水浴鍋（江蘇金壇）；BS124S電子天平（賽多利斯）；DELTA 320酸度計（成都）；800型離心機（江蘇金壇）；恒溫培養(yǎng)箱（長沙）；烘箱（寧波）；層析柱（30×300 mm，上海）。

主要試劑：NaOH、鹽酸、蘆?。˙R，標準品，含量≥95%）、氯化鋁、無水乙醇、D101大孔樹脂、KH2PO4、K2HPO4、NH4Cl、VC、H2O2、豆油、氯仿、冰醋酸、KI、淀粉、鄰二氮雜菲、硫酸亞鐵銨、1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH）、鄰苯三酚、瓊脂、白葡萄菌、大腸桿菌、氨水，以上無特殊說明均為分析純。

1.3 蘆丁吸取曲線和標準曲線

分別吸取 50 μg/mL 的蘆丁標準溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5支10 mL比色管中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以試劑空白作參比，在220 nm～400 nm掃描，繪制吸收曲線和標準曲線。

1.4 柿葉黃酮半仿生法提取

根據(jù)仿生學原理，人體胃、小腸、大腸的體液pH分別為 0.9～1.5、7.6、8.3～8.4。準確稱取 2 g 柿葉粉，依次加入pH≈2.0的鹽酸溶液，pH≈7.5和pH≈8.5的氨-氯化銨緩沖溶液作為提取液，在一定的溫度下回流提取一定時間，合并三次提取液，用70%乙醇定容至150 mL，搖勻，準確吸取1.0 mL稀釋至50 mL，以70%乙醇做參比，在λmax處測定其吸光度A值。選取提取溫度，提取時間，固液比等三因素，進行正交試驗設(shè)計，優(yōu)選半仿生法提取工藝條件。

1.5 柿葉黃酮的抗氧化能力的測定

柿葉提取液經(jīng)D101大孔樹脂進行精制，樹脂的預處理參考文獻[2]。采用濕法裝柱，充分吸附后先用水洗，然后收集70%乙醇洗脫液，干燥后得柿葉總黃酮提取物，用于抗氧化實驗。

1.5.1 柿葉黃酮對DPPH自由基的清除作用

分別取1%柿葉黃酮溶液和1%VC溶液1.0 mL，置于10 mL比色管中，加入3.0 mL 0.04 mg/mL的DPPH乙醇溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，同時以無水乙醇為空白，于517 nm處測定吸光度A值，按下列公式計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為1.0 mL蒸餾水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值；As為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值；Ac為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL無水乙醇的吸光度值。

1.5.2 柿葉黃酮對羥基自由基的清除作用

取3支10 mL比色管分別加入7.5 mmol/L鄰二氮雜菲溶液0.2 mL，加入7.5 mmol/L硫酸亞鐵銨溶液0.2 mL，加入pH≈7.4磷酸鹽緩沖溶液1 mL，在2，3號比色管加入7.5 mmol/L雙氧水1.0 mL，在3號比色管中再加入1.0 mL柿葉黃酮溶液，用去離子水定容至刻度，在37℃水浴中反應(yīng)1 h，冷水冷卻，以水為參比，在508 nm處測其吸光度值，計算清除率。

式中：A1為不加雙氧水和黃酮的吸光度值；A2為只加雙氧水的吸光度值；A3為雙氧水和黃酮均加的吸光度值。

1.5.3 柿葉黃酮對超氧自由基的清除作用

取3 mL pH≈8.0的磷酸鹽緩沖溶液于10 mL比色管中，置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入同體積不同濃度的待測液溶液和0.6 mL 30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中預熱5 min，加入0.5 mL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)，于420 nm處測定吸光度值A(chǔ)1。以同體積的去離子水代替樣品，吸光度記為A0，作空白對照?？紤]到待測液本身可能在420 nm處有吸收，用同體積的去離子水代替鄰苯三酚溶液，得A2，計算清除率。

1.5.4 柿葉黃酮抗油脂過氧化作用

食用油中過氧化物在氯仿-冰醋酸介質(zhì)中，與KI作用定量產(chǎn)生I2，可用淀粉溶液直接顯色，于585 nm處進行定量分析。實驗方法：取4個干凈燒杯，各加入20 g的大豆油，1號加入5 mL去離子水，2號加入5 mL 1%柿葉黃酮溶液，3號加入5 mL 1%VC溶液，4號加入5 mL 2%的柿葉黃酮溶液，充分攪勻后于60℃烘箱內(nèi)，每24 h攪拌一次使其均勻，測量一次A值。

測定方法：精密稱取0.2 g豆油于10 mL比色管中，加2.5 mL（2+3）氯仿-冰醋酸溶解，加入0.1 mL KI飽和溶液，塞緊振蕩30 s，在暗處放置3 min，加1.0 mL淀粉溶液，稀釋至刻度，搖勻靜置5 min，以試劑空白（不加油樣，其余均加）為參比，于580 nm處測定A值，見圖3。

1.6 黃酮提取物抑菌性實驗方法

取1 cm的圓形紙片6片，其中兩片（1號、2號）放入1%黃酮提取液中浸泡6 h，另取兩片（3號、4號）放入1%VC溶液浸泡6 h，其余兩片（5號、6號）放入蒸餾水中浸泡6 h。在無菌操作臺上分別將1號、3號、5號置于在大腸桿菌培養(yǎng)皿中，將2號、4號、6號置于白葡萄菌培養(yǎng)皿中，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，測定抑菌圈直徑，結(jié)果見表5。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收曲線和標準曲線

蘆?。ㄒ掖既芤海┪涨€和蘆丁標準曲線見圖1、圖2。

由圖1吸收曲線可知蘆丁在272 nm有最大吸收，選擇272 nm作為測定波長。

圖1 蘆?。ㄒ掖既芤海┪涨€Fig.1 Absorption curve of Rutin（in ethanol）

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

標準曲線回歸方程：A=33.3C+0.029 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，蘆丁濃度在0～0.025 mg/mL范圍內(nèi)線性較好，可據(jù)此進行定量分析。

2.2 半仿生提取法正交試驗結(jié)果

半仿生法提取柿葉黃酮的正交試驗結(jié)果見表1。

表1 半仿生法正交試驗結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiment for semi-bionic extraction

正交試驗結(jié)果表明最優(yōu)組合為A3B2C3，即半仿生法提取柿葉黃酮的最佳工藝條件為：固液比為1∶20，提取溫度80℃，時間1 h。影響因素主次順序為固液比＞溫度＞回流時間。

2.3 柿葉黃酮抗氧化作用的實驗結(jié)果

自由基是機體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。損害人體健康的主要是活性氧自由基，如超氧陰離子自由基、羥自由基、脂氧自由基二氧化氮和一氧化氮自由基等。DPPH就是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，廣泛用于測定生物試樣和食品的抗氧化能力。

2.3.1 黃酮提取液對DPPH自由基的清除率

柿葉黃酮對DPPH自由基的清除作用結(jié)果見表2。

表2 對DPPH自由基清除實驗結(jié)果Table 2 Results on scavenging DPPH free radical

結(jié)果表明柿葉黃酮有較高的抗DPPH自由基能力，其清除率略高于VC。

2.3.2 黃酮提取液對羥基自由基的清除率

柿葉黃酮對羥基自由基的清除作用結(jié)果見表3。

表3 對羥基自由基的清除實驗結(jié)果Table 3 Results on scavenging hydroxyl radical

表3數(shù)據(jù)表明柿葉黃酮溶液對羥基自由基的清除能力低于VC溶液。

2.3.3 黃酮提取液對超氧陰離子的清除率

柿葉黃酮對超氧自由基的清除作用結(jié)果見表4。

表4 清除超氧自由基實驗結(jié)果Table 4 Results on scavenging superoxide free radical

通過對比發(fā)現(xiàn)，柿葉黃酮溶液對超氧自由基的清除作用高于VC。

2.3.4 柿葉黃酮對大豆油的抗氧化作用

柿葉黃酮對大豆油的抗氧化作用結(jié)果見圖3。

圖3 柿葉黃酮對大豆油的抗氧化作用Fig.3 Antioxidant effect of flavonoid extracted from persimmon leaves on soybean oil

去離子水沒有抗氧化作用，作為參照。由圖3可知，同濃度的柿葉黃酮溶液抗豆油過氧化作用優(yōu)于VC。且濃度增大，抗油脂過氧化作用增強。

2.4 柿葉黃酮提取物抑菌作用實驗結(jié)果

柿葉黃酮對白葡萄菌和大腸桿菌的抑制作用結(jié)果見表5。

表5 抑菌直徑Table 5 Bacteriostatic diameter cm

水對白葡萄菌、大腸桿菌均無抑菌作用，作為對照。一般認為抑菌圈＜0.8 cm為不敏感；0.8 cm～1.3 cm為低度抑菌、1.3 cm～1.9 cm為中度抑菌、＞1.9 cm為高度抑菌。實驗結(jié)果表明：柿葉黃酮溶液對兩種菌類均有中度抑菌作用，且均強于VC。

3 結(jié)論

1）采用半仿生法提取磨盤柿葉中總黃酮，用pH分別為2.0、7.5和8.5的水溶液為提取劑各提取一次，最佳提取條件為：提取溫度80℃，時間1 h，固液比為1 ∶20。

2）柿葉總黃酮表現(xiàn)出較好的抗油脂過氧化和清除自由基作用。其對DPPH自由基清除率為77.44%，對超氧自由基清除率為78.08%，均優(yōu)于VC；對羥基自由基清除率為55.67%，低于VC。柿葉黃酮溶液對供試的白葡萄菌、大腸桿菌均有中度抑制作用，抑菌直徑分別為 1.5 cm、1.7 cm，均高于 VC。

磨盤柿葉總黃酮具有良好的抗自由基、抗油脂氧化及抑制白葡萄菌、大腸桿菌生長作用，可用作天然抗氧化劑、防腐劑，在食品、化妝品、藥品行業(yè)具有廣泛的開發(fā)前景。

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