Aβ1-42寡聚體對(duì)AD大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響

陳 雪，孫婧霞，曹翠麗，蔣常文

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種多發(fā)于老年人，病理改變主要發(fā)生在大腦皮質(zhì)和海馬，以 β 淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉積形成老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)、神經(jīng)元丟失為主要病理特征。目前普遍認(rèn)同AD的主要發(fā)病機(jī)制:具有神經(jīng)毒性的Aβ在腦實(shí)質(zhì)沉積，啟動(dòng)病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成NFT，導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元丟失［1］。Aβ是由39～43個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中，Aβ1-42肽具有較高聚集傾向，是老年斑中最主要的淀粉樣物質(zhì)［2－3］，而且，Aβ1-42 可能參與了突觸改變、細(xì)胞凋亡以及由輕度認(rèn)知功能障礙發(fā)展到AD的進(jìn)程［4］。目前，轉(zhuǎn)基因AD動(dòng)物模型是研究 AD的一大熱點(diǎn)，但該模型缺少衰老過程，不能完全復(fù)制人類AD的所有特征，而且操作技術(shù)復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，因此還不能廣泛應(yīng)用。該研究模擬Aβ沉積，將Aβ1-42少量多次灌注于大鼠側(cè)腦室制備AD模型，利用Morris水迷宮法觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變，用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)大鼠皮質(zhì)Bcl-2、Caspase-3的 mRNA表達(dá)以及 Bcl-2蛋白表達(dá)、Caspase-3活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠65只，SPF級(jí)，250～300 g，2～3月齡，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 Aβ1-42和六氟異丙醇(美國Sigma公司);mRNA提取試劑盒和PCR反應(yīng)體系(北京艾德萊公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和引物(Invitrogen公司);DNA Marker(廣州東盛生物科技有限公司);WIP組織裂解液(北京博奧森公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司);兔抗Caspase-3(Active)一抗(上海藍(lán)基公司);兔抗Bcl-2一抗 (武漢博士德公司);鼠抗β-actin一抗、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗、ECL發(fā)光液(北京中杉金橋公司);PageRulerTM預(yù)染蛋白梯度(上海麥約爾公司);微量給藥系統(tǒng)(深圳瑞沃德公司);實(shí)驗(yàn)所需的儀器由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心和解剖教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 Aβ1-42寡聚體和 Aβ1-42纖維的制備 ①Aβ1-42寡聚體制備:將1 mg Aβ1-42單體溶于六氟異丙醇至濃度為4.5 mg/ml，室溫孵育60 min，真空冷凍蒸發(fā)六氟異丙醇后，加入二甲基亞砜至濃度為22.5 mg/ml，超聲浴處理10 min，加入含有0.2%SDS的PBS，稀釋濃度至2.5 mg/ml，4℃孵育24 h后，用PBS稀釋至終濃度1 mg/ml，4℃孵育2周。② Aβ1-42纖維的制備:Aβ1-42溶于PBS中，濃度為1 mg/ml，37℃孵育7 d，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂瘧B(tài)的 Aβ1-42，4 ℃保存。

1.2.2 AD動(dòng)物模型的制備 通過Morris水迷宮試驗(yàn)，將逃避潛伏期少于60 s的健康雄性SD大鼠60只隨機(jī)分成4組(n=15):正常組、PBS對(duì)照組、Aβ1-42纖維組、Aβ1-42寡聚體組。用10%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，頭頂部備皮。將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，手術(shù)區(qū)消毒，在顱頂中間部作一縱切口，暴露顱骨，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，前囟后0.8 mm，中線旁開1.5 mm，用牙科鉆鉆開顱骨，垂直插入微量給藥導(dǎo)管(長度3.5 mm)，用牙托粉和義齒基托樹膠將給藥導(dǎo)管固定于顱骨表面，縫合皮膚，肌肉注射青霉素8萬單位/只，預(yù)防感染。通過微量注射內(nèi)管，每天給予Aβ1-42纖維或Aβ1-42寡聚體 5 μg，連續(xù)給藥5 d。PBS對(duì)照組采用同樣的方法給予等量的PBS，正常組不作任何處理。

1.2.3 Morris水迷宮測(cè)試大鼠行為學(xué)習(xí)記憶能力的變化 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)包括一不銹鋼圓形水池、一可調(diào)換位置的圓形透明的有機(jī)玻璃平臺(tái)，電腦以及連接電腦的攝像機(jī)。Morris水迷宮圓形水池等分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于第4象限中央位置，平臺(tái)低于水面2 cm。在各象限中間標(biāo)記入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁分別從3個(gè)入水點(diǎn)(不包括第4象限入水點(diǎn))放入水中，若大鼠入水后60 s未能找到平臺(tái)，則把大鼠從水中拖上平臺(tái)，并停留10 s，接著進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每組大鼠在造模前均進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，從訓(xùn)練的第3天開始，記錄大鼠從入水尋找并爬上平臺(tái)所需要的時(shí)間(即逃避潛伏期)，連續(xù)測(cè)試5 d，每天測(cè)試2次，兩次平均值為當(dāng)天逃避潛伏期。造模結(jié)束后的第4周采用同樣的方法對(duì)大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)試5 d，每天2次。根據(jù)每組大鼠造模前后逃避潛伏期的長短判斷各組大鼠記憶能力的變化情況。水迷宮實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜，周圍參照物不變，室內(nèi)日光燈照明，水溫25℃，時(shí)間一般選在10∶00～12 ∶00，15 ∶00 ～17 ∶00。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)AD大鼠皮質(zhì)Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA的表達(dá) PCR反應(yīng)體系(參考PCR說明書):Taq Master Mix 12.5 μl，上下游引物各 1 μl(10 μm)，模板 DNA 4 μg，加 DEPC 水補(bǔ)至25 μl。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃ 30 s、退火50～60℃ 30 s、延伸72℃ 1 min(30個(gè)循環(huán))，終延伸72℃ 5 min。Bcl-2引物序列:上游為5'-GCCTTCTTTGAGTTCGGT-3'，下 游 為 5'-TCAAACAGAGGTCGCAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長188 bp;Caspase-3引物序列:上游為 5'-CAGAGCTGGACTGCGGTATT-3'，下 游為 5'-CCATGACCCGTCCCTTGAAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長146 bp;β-actin引物序列:上游為 5'-CCTTCTTGCAGCTCCTCCGTC-3'，下游為 5'-TCTCCATATCGTCCCAGTTGGTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長299 bp。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用LeicaQ5100W型全自動(dòng)圖像分析儀分析電泳結(jié)果。

1.2.5 Western blot檢測(cè) AD大鼠皮質(zhì) Bcl-2蛋白表達(dá)及Caspase-3活性 造模后水迷宮試驗(yàn)后，從各組中隨機(jī)選取5只大鼠斷頭取腦，分離皮質(zhì)，依照WIP組織細(xì)胞裂解液說明書提取蛋白，用BCA法檢測(cè)樣本蛋白濃度。樣品的上樣體積為30 μl(總蛋白量為30 μg)，用12%的凝膠進(jìn)行 SDS-PAGE電泳;轉(zhuǎn)膜后以5%的脫脂奶封閉液封閉;一抗(1∶300)孵育2 h;用TBST洗膜3次(10 min/次);加入二抗(1∶6 000)孵育1 h;洗膜。用Western blot發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影、定影。用全自動(dòng)數(shù)碼成像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力的變化(逃避潛伏期)造模前各組大鼠的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后，Aβ1-42纖維組、Aβ1-42寡聚體組大鼠逃避潛伏期與正常組和PBS對(duì)照組相比均延長(P＜0.05)，以Aβ1-42寡聚體組變化更顯著。見表1。

表1 逃避潛伏期的變化(s，n=15，±s)

表1 逃避潛伏期的變化(s，n=15，±s)

與正常組比較:*P＜0.05;與Aβ1-42寡聚體組比較:#P＜0.05;與造模前比較:ΔP＜0.05

?

2.2 皮質(zhì) Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平 與正常組相比，Aβ1-42纖維組、Aβ1-42寡聚體組的Bcl-2 mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)，而Caspase-3 mRNA的表達(dá)增高(P＜0.05);與Aβ1-42纖維組比較，Aβ1-42寡聚體組變化更明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(n=5，xˉ±s)

圖2 各組大鼠皮質(zhì)Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平(n=5，±s)

2.3 皮質(zhì)Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 Aβ1-42纖維組和Aβ1-42寡聚體組大鼠皮質(zhì)Bcl-2蛋白表達(dá)比正常組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而有活性的Caspase-3在Aβ1-42纖維組和Aβ1-42寡聚體組表達(dá)增高(P＜0.05)。見圖2。

3 討論

3.1 Aβ1-42寡聚體神經(jīng)毒性對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響 AD患者腦內(nèi)老年斑的Aβ主要是以纖維體的形式存在，Aβ寡聚體是纖維體的一種過渡形式，是目前認(rèn)為具有較大神經(jīng)毒性的Aβ存在形式。Aβ對(duì)神經(jīng)元有毒性作用，在體內(nèi)外均可引起神經(jīng)元凋亡，其異常代謝將會(huì)導(dǎo)致各種病理改變，在AD發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用［5］。

利用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。大腦額葉皮質(zhì)和海馬在學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用。當(dāng)大腦皮質(zhì)和海馬病變時(shí)，其學(xué)習(xí)記憶能力會(huì)受到影響，而具有神經(jīng)毒性的Aβ寡聚體主要沉積在皮質(zhì)和海馬中，從而影響學(xué)習(xí)記憶能力。本研究在造模前進(jìn)行的水迷宮試驗(yàn)主要是觀察大鼠的學(xué)習(xí)能力，而給藥后再次使用水迷宮試驗(yàn)是對(duì)記憶的提取和再鞏固，根據(jù)造模前后兩次逃避潛伏期長短的變化來判斷Aβ寡聚體對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，造模前各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力無明顯差異，造模4周后，Aβ1-42纖維組、Aβ1-42寡聚體組逃避潛伏期較造模前均延長，但以Aβ1-42寡聚體組變化更顯著，正常組和PBS對(duì)照組無明顯變化，由此可知Aβ1-42寡聚體比Aβ1-42纖維毒性更大，更易損害AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。當(dāng)寡聚體Aβ轉(zhuǎn)化成纖維化Aβ，其神經(jīng)毒性會(huì)降低。成年動(dòng)物大腦皮質(zhì)神經(jīng)元在正常情況下不具有分裂增殖能力，但在一定誘導(dǎo)條件下可分裂再生。Varvel et al［6］發(fā)現(xiàn)在體外制備的Aβ寡聚體，在皮質(zhì)神經(jīng)元分裂的過程中可誘導(dǎo)DNA的合成，但這一過程可被特定的Aβ寡聚體抗體阻止，低分子量的Aβ寡聚體可誘導(dǎo)AD模型小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期。

3.2 Caspase-3與 Aβ1-42寡聚體的細(xì)胞毒性Caspase-3在細(xì)胞凋亡中扮演重要角色。有研究［7］表明Caspase-3首先定位于AD患者突觸后密集區(qū)，并在這一區(qū)域表達(dá)升高，其在突觸變性疾病進(jìn)展過程中起重要作用。本研究檢測(cè)各組AD大鼠皮質(zhì)的Caspase-3 mRNA的表達(dá)及Caspase-3活性，與正常組及PBS對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42纖維組和Aβ1-42寡聚體組皮質(zhì) Caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)，Caspase-3活性增高，其在Aβ1-42寡聚體組中變化更顯著，故可知 Aβ1-42寡聚體能誘導(dǎo) Caspase-3 mRNA表達(dá)，激活Caspase-3，更容易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有活性的Caspase-3會(huì)引發(fā)廣泛的神經(jīng)元破壞和退化，但不引起神經(jīng)元細(xì)胞急性死亡［8］。

3.3 Bcl-2與Caspase-3的關(guān)系 Bcl-2是一個(gè)抑制凋亡基因，作為Caspase上游調(diào)控機(jī)制，其過度表達(dá)能抑制各種因素誘發(fā)的Caspase激活和凋亡，可能通過抑制細(xì)胞色素C等從線粒體的釋放調(diào)控著線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開啟，從而抑制Caspase-3活化。另外，Bcl-2還可阻止線粒體釋放Caspase-3，并抑制其合成［9］。Bcl-2又是Caspase-3的直接底物，Bcl-2蛋白的環(huán)區(qū)可被 Caspase-3在 Asp34處剪切［10］。如果Bcl-2表達(dá)水平改變的同時(shí)伴隨著天門冬氨酸受體的改變，可導(dǎo)致鈣離子失衡，從而激活Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。

本研究顯示，與正常組和 PBS對(duì)照組相比，Aβ1-42纖維組及 Aβ1-42寡聚體組皮質(zhì)中 Bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白表達(dá)均降低，其中Aβ1-42寡聚體組的Bcl-2變化更明顯。由此可知當(dāng)Aβ1-42激活Caspase酶原后，Bcl-2表達(dá)減少，細(xì)胞抑制凋亡的能力減弱，促凋亡的作用增強(qiáng)。

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