乙肝病毒HBx基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立及其誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

陸 鵬，姜同翠，陳 露，沈玉君，沈玉先，方圣云

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的慢性乙型肝炎被普遍認(rèn)為是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)半數(shù)以上的肝癌患者有慢性乙肝病史。研究［1－3］顯示亞洲和北美地區(qū)乙肝抗原陽(yáng)性攜帶者罹患肝癌的比例是非感染人群的25～37倍。HBV是嗜肝DNA病毒家族的溶原性病毒，基因組呈雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，含有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架，分別為S、P、C、X區(qū)，其中 X區(qū)所編碼的產(chǎn)物 HBx蛋白(hepatitis B virus X protein)是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，具有廣泛的反式激活功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)應(yīng)激是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，是通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)通路，以此來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)蛋白的異常聚集，起到細(xì)胞保護(hù)作用。近年來(lái)ER應(yīng)激相關(guān)調(diào)節(jié)因子參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展受到廣泛關(guān)注，但關(guān)于HBV病毒HBx蛋白的過(guò)度表達(dá)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，目前仍不清楚。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆HBx基因并建立穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞系，觀(guān)察HBx的過(guò)度表達(dá)是否可引起ER應(yīng)激及對(duì)肝癌細(xì)胞增殖活性的影響，為后續(xù)相關(guān)機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、菌株及質(zhì)粒 人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);表達(dá)HBV全基因組的肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15為沈繼龍教授惠贈(zèng);菌株E.coli DH5α 為本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒 pcDNA3.1 Vector為美國(guó)馬里蘭大學(xué)方圣云教授惠贈(zèng);真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HBx由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司;質(zhì)粒大量提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;G418購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;DNA連接酶、ExTaq和各種限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 引物 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

1.1.4 抗體 乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)抗體購(gòu)自美國(guó)BBI公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)所需的引物使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)GenBank上HBx基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，HBx-F包含了HindⅢ酶切位點(diǎn)(表1中下劃線(xiàn)標(biāo)注)，引物HBx-R包含了EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，見(jiàn)表1。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 以 HepG2.2.15細(xì)胞 DNA 為模板，使用上游引物HBxF和下游引物HBxR，PCR擴(kuò)增HBx序列。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 35 個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后72℃10 min反應(yīng)結(jié)束。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒進(jìn)行純化。將回收的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體分別進(jìn)行雙酶切，限制性?xún)?nèi)切酶為HindⅢ和EcoRⅠ。酶切后將擴(kuò)增片段連接入pcDNA3.1載體并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后再使用HindⅢ和EcoRⅠ酶切鑒定。酶切片段正確的pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒由美國(guó)Invitrogen公司測(cè)序。

表1 PCR引物序列

1.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立及HBx蛋白表達(dá)的鑒定將HepG2細(xì)胞接種到培養(yǎng)板上，待匯合度達(dá)80%～90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。50 μl Opti-MEM 稀釋 1 μg pcDNA3.1-HBx質(zhì)?；靹?，同樣稀釋 2 μl脂質(zhì)體 lipofectamine 2000于Opti-MEM中，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。48 h后用G418進(jìn)行篩選，濃度選擇0.5 g/L。同理轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體作對(duì)照。該細(xì)胞系生長(zhǎng)穩(wěn)定后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，用HBx抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 HBx對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞、穩(wěn)轉(zhuǎn)空載體的HepG2細(xì)胞、穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx蛋白的HepG2細(xì)胞按1×104/孔的密度接種到96孔板里，設(shè)立不接種細(xì)胞的空白對(duì)照，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔各加入100 μl MTT(5 g/L)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后終止培養(yǎng)。小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，測(cè)定前震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。以空白對(duì)照調(diào)零，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度(optical density，OD)值。

1.2.5 HBx誘導(dǎo)的ER應(yīng)激 選取ER應(yīng)激相關(guān)基因，包括 PERK、BIP、MANF、ATF-6、XBP-1 和 CHOP，用RT-PCR方法檢測(cè)其在HepG2細(xì)胞中和過(guò)表達(dá)HBx蛋白的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s T法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HBx基因的克隆及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 收集培養(yǎng)的HepG2.2.15細(xì)胞，提取DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，在約500 bp處可見(jiàn)明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，見(jiàn)圖1A，該電泳結(jié)果和理論預(yù)測(cè)值相符。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，然后連接到pcDNA3.1載體上以構(gòu)建pcDNA3.1-HBx真核表達(dá)質(zhì)粒，pcDNA3.1載體上有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，見(jiàn)圖2。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，收集細(xì)菌抽提質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，在465 bp處有一條帶，見(jiàn)圖1B，與基因PCR產(chǎn)物的大小一致，表明目的基因已成功插入pcDNA3.1質(zhì)粒中，重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1-HBx構(gòu)建成功。測(cè)得的序列在Pubmed里用BLAST檢測(cè)與預(yù)期序列一致。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及重組質(zhì)粒酶切鑒定

圖2 質(zhì)粒pcDNA3.1-HBx的圖譜

2.2 HBx穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立及HBx蛋白表達(dá)的鑒定 將構(gòu)建的pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞，用G418(0.5 g/L)篩選，然后將細(xì)胞充分稀釋以便克隆挑選。挑取單個(gè)克隆，見(jiàn)圖3A，轉(zhuǎn)至6孔板中培養(yǎng)，用G418維持篩選以建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。收集細(xì)胞并提取蛋白質(zhì)進(jìn)行PAGE膠電泳，用抗HBx抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx的HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞中有HBx蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖3B。

圖3 HBx穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立及HBx蛋白表達(dá)的鑒定

2.3 HBx的表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響用MTT法對(duì)各組細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示，HepG2.2.15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空白載體的 HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)72 h時(shí)，其增殖活性與HepG2細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx的HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)72 h時(shí)其增殖活性明顯高于穩(wěn)轉(zhuǎn)空白載體的HepG2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.542，P ＜0.01)，見(jiàn)圖4。

2.4 HBx對(duì)ER應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響 用RT-PCR方法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中ER應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá) HBx蛋白的HepG2 細(xì)胞中，BIP、PERK、ATF-6、XBP-1 和 MANF表達(dá)上調(diào)，而CHOP則表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖5。這些結(jié)果提示HBx蛋白的過(guò)表達(dá)可能引起ER應(yīng)激。

3 討論

圖4 HBx的表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

圖5 HBx的表達(dá)對(duì)ER應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

HBx蛋白在激活HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［4］，其能夠參與肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路和DNA修復(fù)中發(fā)揮多種功能［5－7］。然而，關(guān)于HBV感染導(dǎo)致肝硬化和肝癌的分子機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，包括HBx蛋白如何促進(jìn)肝硬化和肝癌的發(fā)生發(fā)展。HBV基因組編碼的X蛋白被認(rèn)為是肝炎病毒侵入宿主后介導(dǎo)HBV基因組整合和促進(jìn)HBV復(fù)制過(guò)程的主要調(diào)節(jié)因子［8］。X蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可發(fā)生肝癌;患者體內(nèi)X蛋白的表達(dá)量與肝癌的發(fā)生呈明顯的相關(guān)性;這些研究［1，8－9］結(jié)果提示X蛋白是促進(jìn)肝癌發(fā)生的主要因素之一。研究［8，10］表明X蛋白在某種狀況下入核，影響體內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如 AP-1、NF-κB、STAT3 和CREB/ATF等，使得TNF、TGF-β等基因的表達(dá)發(fā)生變化，以此促進(jìn)炎癥向腫瘤的轉(zhuǎn)化、增殖和轉(zhuǎn)移。其中TGF-β被認(rèn)為是促進(jìn)肝臟纖維化乃至肝硬化的重要調(diào)節(jié)因子［11］。但也有研究［12］顯示 HBx蛋白可以通過(guò)影響細(xì)胞凋亡蛋白酶的活性和線(xiàn)粒體的功能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

HBV表達(dá)可以誘發(fā)ER應(yīng)激反應(yīng)并激活I(lǐng)RE1-XBP1 通路［13－14］。進(jìn)一步研究［15］顯示，HBV 表面抗原pre-S2突變體蛋白會(huì)引起ER應(yīng)激。pre-S是HBV的一種表面蛋白，其突變型可以逃避宿主免疫攻擊，在ER腔內(nèi)大量聚集，產(chǎn)生嚴(yán)重而持久的ER應(yīng)激反應(yīng)，其存在使患者發(fā)展為肝癌的概率大大增加，這也提示ER應(yīng)激反應(yīng)與肝癌發(fā)生之間的密切關(guān)系［16］。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和ER應(yīng)激間會(huì)相互促進(jìn)，HBV感染后引起宿主的先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，其炎癥細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子、趨化因子、糖類(lèi)或脂類(lèi)代謝產(chǎn)物，并產(chǎn)生大量活性氧成分，可引起ER應(yīng)激反應(yīng)。而ER應(yīng)激反應(yīng)又可通過(guò)釋放鈣離子作用于線(xiàn)粒體促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的加劇可促進(jìn)正常肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［17］。

本研究顯示，HBx的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)UPR相關(guān)基因?qū)^(guò)表達(dá)HBx的反應(yīng)性不同，HBx蛋白可引起 PERK、BIP、MANF、ATF-6和XBP-1表達(dá)升高，而使CHOP表達(dá)降低，提示HBx通過(guò)作用于不同的UPR通路介導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷和促使肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。CHOP是一個(gè)促凋亡基因，其低表達(dá)可能參與了肝癌細(xì)胞的過(guò)度增殖。至于HBx對(duì)UPR基因差異性調(diào)節(jié)的原因，可能與ER應(yīng)激本身具有促增殖和促凋亡的兩重性有關(guān)。由此推測(cè)ER應(yīng)激及UPR通路的激活/抑制貫穿于肝炎到肝癌的全過(guò)程，各通路間可能存在平衡和補(bǔ)償機(jī)制。

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