白藜蘆醇對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1基因表達的干預作用

張篤貞 張滌 孫鵬 王冬蘭

白藜蘆醇對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1基因表達的干預作用

張篤貞 張滌 孫鵬 王冬蘭

白藜蘆醇;糖尿病視網(wǎng)膜病變;SIRT1;p53

目的觀察白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)基因表達的影響，探討其對糖尿病視網(wǎng)膜病變可能的作用機制。方法隨機選擇15只正常大鼠為正常對照組(NC組)，STZ成功誘導糖尿病模型大鼠57只，用隨機數(shù)字表法分為糖尿病模型(DC)組、Res低劑量給藥(RL)組、Res高劑量給藥(RH)組，每組各19只。各組分別選擇不同劑量Res灌胃12周，蘇木精-伊紅染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織病理學改變，免疫組織化學染色檢測抗癌基因p53蛋白表達，RT-PCR檢測SIRT1、p53 mRNA在大鼠視網(wǎng)膜中的表達情況。結果HE染色結果顯示：NC組視網(wǎng)膜結構層次清晰；DC組較NC組視網(wǎng)膜變薄，結構破環(huán)，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少；RL組較DC組略有改善；RH組視網(wǎng)膜結構基本正常。免疫組織化學染色結果顯示：DC組、NC組、RL組、RH組大鼠p53陽性細胞核數(shù)目分別為(103.857 1±8.071 1)個、(9.142 9±2.035 4)個、(63.714 3±6.750 7)個、(15.751 4±1.988 1)個，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。DC組、NC組、RL組、RH組SIRT1 mRNA相對表達量分別為 1.234 6±0.026 0、1.499 3±0.098 8、1.269 7±0.0280、1.392 1±0.053 1，DC組均低于RL組、RH組、NC組，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。DC組、NC組、RL組、RH組p53 mRNA相對表達量分別為1.503 4±0.081 3、0.952 0±0.110 2、1.429 3±0.110 0、1.027 1±0.088 7，DC組均高于RL、RH、NC組，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。結論Res對糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜損害具有一定的保護作用，其機制可能與Res促進視網(wǎng)膜中SIRT1的表達從而抑制視網(wǎng)膜的細胞凋亡有關。

[眼科新進展，2014，34(4)：322-325]

糖尿病是影響全身各組織器官血管功能并引發(fā)其病變的內(nèi)分泌疾病，嚴重影響人類健康[1]。而糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥之一。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)目前已被國內(nèi)外學者廣泛應用于糖尿病腎病的研究中，但有關其對DR的干預作用及其機制的相關報道尚少。而Res對DR大鼠沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)的干預作用，國內(nèi)外研究者均未涉及。本實驗以Wistar大鼠為研究對象，建立鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的DR模型，觀察Res對SIRT1 mRNA表達的影響，旨在進一步探討DR的發(fā)病機制及Res對DR早期的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物清潔級Wistar大鼠80只(長春億斯動物實驗中心)，雌雄各半，鼠齡為(55±5)d，體質量160～220 g。

1.2主要藥品及試劑Res(西安冠宇生物技術有限公司)；STZ、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；p53一抗(武漢博士德生物有限公司)；Trizol、DEPC(大連寶生物有限公司)；RT-PCR試劑盒(Fermentas公司)；DNA marker(北京博邁德生物技術有限公司)；Taq PCR Master Mix試劑(北京百泰克生物技術有限公司)；血糖儀及血糖試紙(德國羅氏公司)。

1.3糖尿病動物模型的建立與分組所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，應用隨機數(shù)字表法留取15只為正常對照(NC)組，剩余65只大鼠單次腹腔注射60 mg·kg-1STZ以建立糖尿病動物模型，注射時用pH 4.2的0.1 mol·L-1枸櫞酸緩沖液溶解STZ至10 g·L-1。3 d后鼠尾靜脈采血測空腹血糖，血糖濃度≥16.7 mmol·L-1者即為糖尿病動物模型造模成功。剔除血糖<16.7 mmol·L-1的3只大鼠以及5只死亡大鼠。將造模成功后57只大鼠納入實驗，用隨機數(shù)字表法隨機分為糖尿病模型(DC)組、Res低劑量給藥(RL)組、Res高劑量給藥(RH)組，每組各19只。自造模成功后第2天起，RL組以Res混懸液(20 g·L-1Res+0.022 g·L-1DMSO)20 mg·kg-1·d-1灌胃，RH組以Res混懸液(100 g·L-1Res+0.022 g·L-1DMSO)100 mg·kg-1·d-1灌胃，NC組、DC組以等量DMSO溶液灌胃，持續(xù)12周。

1.4取材處理在末次給藥次日處死大鼠，左眼采用石蠟包埋組織化學技術，對各組切片行組織病理學及免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織病理學改變及P53蛋白表達情況。4 ℃取右眼視網(wǎng)膜組織，組織勻漿和液氮中保存?zhèn)溆?，各組樣本行SIRT1、p53 mRNA復合逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriplion-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測。

1.5指標測定

1.5.1組織病理學及免疫組織化學檢測大鼠左眼浸泡于40 g·L-1多聚甲醛溶液中24 h，經(jīng)脫水、浸蠟、切片后制成4 μm厚大鼠視網(wǎng)膜組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學改變。按照SP及DAB顯色試劑盒步驟進行免疫組織化學染色，一抗為兔抗大鼠p53抗體(1100稀釋)，二抗為生物素羊抗兔lgG(1100稀釋)，DAB顯色，蘇木精-伊紅復染，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察p53蛋白表達情況，以視網(wǎng)膜細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性，每張切片在陽性表達區(qū)域選擇5個無重疊高倍視野，采用雙盲法平均計數(shù)陽性細胞核數(shù)。

1.5.2RT-PCR法測定SIRT1、p53mRNA表達按照試劑盒說明Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA完整性，用DU-800紫外分光光度計檢測RNA含量。選取OD值1.8～2.2的總RNA(500 ng)為模板進行反轉錄，反轉錄條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃結束。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，行RT-PCR反應。PCR反應體系：Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1.0 μL，反轉錄產(chǎn)物 1.0 μL，滅菌蒸餾水9.5 μL (PCR引物見表1)。

表1 各基因的PCR引物Table 1 PCR primers of each gene

PCR擴增條件(最佳退火溫度)：95 ℃預變性2～5 min；95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)30～35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃結束。

PCR 產(chǎn)物5 μL行溴化乙啶(ethidium bromide,EB)配制的20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，120 V電泳30 min。凝膠成像系統(tǒng)(Quantity One)進行數(shù)據(jù)分析，以各組中cDNA擴增產(chǎn)物的條帶與β-actin條帶灰度值比值表示mRNA 表達水平。

2 結果

2.1組織病理學及免疫組織化學檢測HE染色結果顯示(圖1):NC組大鼠視網(wǎng)膜基本結構層次分明，細胞排列緊密、整齊；DC組較NC組大鼠視網(wǎng)膜各層厚度變薄，內(nèi)核層尤為明顯，內(nèi)界膜斷裂，神經(jīng)節(jié)細胞水腫，數(shù)目減少，細胞排列不規(guī)則;RL組較DC組略有改善；RH組大鼠視網(wǎng)膜組織結構基本正常，較DC組明顯改善。免疫組織化學染色結果顯示(圖2):NC組大鼠僅視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層細胞核內(nèi)可見黃色或棕黃色顆粒，P53蛋白陽性細胞核數(shù)為(9.142 9±2.035 4)個； DC組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)核層及外核層細胞核內(nèi)均出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒，P53蛋白陽性細胞核數(shù)為(103.857 1±8.071 1)個，較NC組明顯增多；RL組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)核層細胞核內(nèi)可見黃色或棕黃色顆粒，P53蛋白陽性細胞核數(shù)為(63.714 3±6.750 7)個，較DC組有所改善；RH組大鼠P53蛋白主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層表達，內(nèi)核層可見極少量黃色或棕黃色顆粒，P53蛋白陽性細胞核數(shù)為(15.751 4±1.988 1)個，較DC組、RL組明顯減少；各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

Figure 1 Pathological changes of rats retina in different groups (HE, ×100). A: Group NC; B: Group DC; C: Group RL; D: Group RH 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化情況(HE，×100)。A：NC組；B：DC組；C:RL組；D：RH組

Figure 2 Expression of p53 in rats retina of different groups detected by immunohistochemical staining (×400). A: Group NC; B: Group DC; C: Group RL; D: Group RH 免疫組織化學法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜中p53的表達情況(×400)。A：NC組;B：DC組;C:RL組;D：RH組

2.2RT-PCR檢測NC組、DC組、RL組、RH組大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1/β-actin的相對灰度值分別為1.499 3±0.098 8、1.234 6±0.026 0、1.269 7±0.028 0、1.392 1±0.053 1，DC組大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1 mRNA的表達較NC組、RL組、RH組明顯降低，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。NC組、DC組、RL組、RH組大鼠視網(wǎng)膜中p53/β-actin的相對灰度值分別為 0.952 0±0.110 2、1.503 4±0.081 3、1.429 3±0.110 0、1.027 1±0.088 7，NC組、RL組、RH組大鼠視網(wǎng)膜中p53 mRNA的表達較DC組降低，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05，見圖3)。

3 討論

DR的發(fā)病基礎是視網(wǎng)膜血管微循環(huán)障礙，其最早出現(xiàn)的病理變化是周細胞缺失，基本病理改變?yōu)檠?視網(wǎng)膜屏障破壞及新生血管形成[2]。大量研究表明，周細胞的缺失與細胞凋亡密切相關[3]，曾有文獻報道，DR也存在神經(jīng)細胞的凋亡[4]。本實驗也表明，STZ誘導的糖尿病大鼠模型可出現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細胞的水腫及數(shù)目減少、視網(wǎng)膜的結構破壞等DR早期病理學改變。而氧化應激、糖基化終產(chǎn)物生產(chǎn)增加及蛋白激酶C的激活均可誘導視網(wǎng)膜細胞凋亡，導致DR。由于視網(wǎng)膜細胞膜中含有大量多不飽和脂肪酸，耗氧量及葡萄糖氧化作用最多，因此相對于其他組織來說，視網(wǎng)膜組織對氧化應激反應更敏感。目前認為氧化應激可導致周細胞及神經(jīng)細胞的凋亡，已經(jīng)成為防治DR的重要靶點。

Figure 3 Relative expressions of SIRT1 and P53 mRNA compared with β-actin mRNA in rats retina of different groups 各組大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1 mRNA、p53 mRNA較β-actin mRNA的相對表達量

SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的第Ⅲ組組蛋白去乙?；?，廣泛存在于多物種之中，在轉錄沉默、染色質穩(wěn)態(tài)、DNA損傷后修復、延長細胞周期中起著重要作用[5]。SIRT1具有調(diào)節(jié)多種可控制代謝及內(nèi)分泌信號的轉錄因子，包括p53[6]、核因子-κB(NF-κB)[7]、叉頭轉錄因子O亞家族(forkhead O subfamily,FOXO)[8]、過氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome prolifer-active activated receptor gamma,PPAR-γ)[9]、PPAR-γ共激活物1-α(peroxisome proliferative activated receptor gamma coactivator 1-α,PGC1-α)[10]等。p53是SIRT1的生理性底物之一，SIRT1可通過使抑癌基因p53特異位點的賴氨酸殘基發(fā)生去乙酞化作用從而負性調(diào)節(jié)其活性[11]。Luo等[12]發(fā)現(xiàn)SIRT1 能使促凋亡因子p53蛋白的lys382去乙?；?，抑制p53與靶DNA順式原件結合，減少由p53誘導的氧化應激反應及DNA損傷導致的細胞凋亡，從而使視網(wǎng)膜細胞的存活率升高。野生型SIRT1的過量表達可以逆轉輻射誘導的p53乙?；?，并且降低p53靶蛋白p21的水平，有降低大鼠視網(wǎng)膜周細胞凋亡及延長視網(wǎng)膜細胞壽命的可能[12-13]。本研究結果顯示，高糖狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1 mRNA的表達明顯減少，P53蛋白及mRNA水平的表達均明顯增多，表明在DR早期SIRT1、p53的平衡狀態(tài)已受到破壞，其表達量的變化進一步誘導了DR病情的發(fā)展。

Res是非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖、藜蘆等植物中[14]，是SIRT1的天然激動劑[8,10]。Res具有降低血脂、抗血小板聚集、誘導腫瘤細胞凋亡、提高免疫功能、降低脂質過氧化、促進抗氧化防御作用等生理活性[15]。研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類動物能量限制的情況下，其肝臟、胰腺、肌肉、大腦及脂肪組織中的SIRT1表達增高[16-17]。有研究認為Res能夠提高SIRT1酶活性并提高乙酰化底物的親和力[14,18]，可有效清除羥基和過氧化物，抵御脂質過氧化物產(chǎn)生的自由基對細胞膜和DNA的損害[19]。本研究結果顯示，在應用不同劑量Res治療一段時間后，大鼠視網(wǎng)膜組織結構、細胞形態(tài)及數(shù)目均有改善，SIRT1 mRNA的轉錄和表達增多，p53 mRNA水平的表達相應減少，RL組、RH組與DC組差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，RH組效果優(yōu)于RL組(P<0.05)。因此說明，在本實驗條件下，SIRT1可能是通過抑制下游底物p53信號通路從而影響視網(wǎng)膜細胞代謝，早期應用Res可提高SIRT1酶的活性，改善和延緩DR的發(fā)展，且100 mg·kg-1·d-1Res的治療效果尤為明顯。

綜上所述，SIRT1有可能成為DR防治的新作用靶點，Res可以改善早期DR的發(fā)展，其治療應考慮在DR早期就進行，以期在其初期抑制視網(wǎng)膜的組織病理改變，延緩甚至控制其進一步的發(fā)展。本研究結果為早期DR的藥物治療提供一條新的思路，但Res對DR防治的作用機制還有待于進一步探索。

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date：Sep 27，2013

Effects of resveratrol on SIRT1 gene expression in retina of diabetic rat

ZHANG Du-Zhen,ZHANG Di,SUN Peng,WANG Dong-Lan

resveratrol; diabetic retinopathy; SIRT1; P53

Objective To observe the effects of resveratrol (Res)on the silent mating type information ragulation 2 homolog 1 (SIRT1)expression in retina of diabetic rats induced by streptozotocin (STZ), and explore its possible effective mechanisms on diabetic retinopathy. Methods Fifteen normal rats were set as normal control group (group NC), 57 diabetic rats induced by STZ were random divided into diabetic model (DC)group, low Res dosage of medicine (RL)group, and high Res dosage of medicine (RH)group, 19 rats in each group. Each group was given different dose of Res by intragastric administration for 12 weeks, the rat retinal tissue pathological changes were observed by HE staining, immunohistochemical staining was used to observe P53 protein expression, and RT-PCR was used to assay SIRT1 and P53 mRNA expression in the rat retina.Results HE staining showed that the structures of the rat retinas of group NC were clear. The retinas of group DC became thin, structures were damaged, retinal ganglion cells reduced. Compared with group DC, the situations of group RL improved slightly. The structures of group RH were almost normal. Immunohistochemical staining showed that the number of yellow or brown granules in the nucleuses of rats retinas of group DC, group NC, group RL and group RH were 103.857 1±8.071 1, 9.142 9±2.035 4, 63.714 3±6.750 7 and 15.751 4±1.988 1, respectively, there were statistical differences between each group (allP<0.05).The expression of SIRT1 mRNA in the retina of group DC, group NC, group RL and group RH were 1.234 6±0.026 0, 1.499 3±0.098 8, 1.269 7±0.028 0 and 1.392 1±0.053 1, respectively, the group DC were lower than the group RL, group RH, group NC, there were statistical differences between each group (allP<0.05). The expressions of P53 mRNA in the retina of group DC, group NC, group RL and group RH were 1.503 4±0.081 3, 0.952 0±0.110 2, 1.429 3±0.110 0 and 1.027 1±0.088 7, respectively, the group DC were higher than the group RL, group RH, group NC, there were statistical differences between each group (allP<0.05).Conclusion Res has certain protective effects on the retinal damage of diabetic rats, its mechanism may be related with Res increasing SIRT1 expression in the retina and inhibiting retinal cell apoptosis.

張篤貞，女，1983年1月出生，山東人，在讀碩士研究生。聯(lián)系電話：15245459556；E-mail: 18188894@qq.com

AboutZHANGDu-Zhen:Female,born in January,1983.Postgraduate student.Tel:15245459556；E-mail: 18188894@qq.com

2013-09-27

154007 黑龍江省佳木斯市，佳木斯大學臨床醫(yī)學院(張篤貞)；154002 黑龍江省佳木斯市，佳木斯大學附屬第一醫(yī)院眼科(張滌,孫鵬,王冬蘭)

王冬蘭， E-mail: wdloph@163.com

張篤貞,張滌,孫鵬,王冬蘭.白藜蘆醇對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1基因表達的干預作用[J].眼科新進展,2014,34(4):322-325.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0087

修回日期：2013-12-19

本文編輯：付中靜

Accepteddate:Dec 19，2013

From theClinicalCollegeofJiamusiUniversity(ZHANG Du-Zhen)，Jiamusi154007,HeilongjiangProvince,China;DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity(ZHANG Di,SUN Peng,WANG Dong-Lan),Jiamusi154002,HeilongjiangProvince,China

Responsibleauthor:WANG Dong-Lan,E-mail: wdloph@163.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(4):322-325]