去整合素Echistatin對(duì)糖尿病兔后發(fā)性白內(nèi)障模型中晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化及膠原合成的影響△

陳迎迎 譚少健 梁皓 錢光霞

已有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者行白內(nèi)障術(shù)后后囊膜混濁 (posterior capsular opacification，PCO)的發(fā)生率明顯高于血糖正常者［1］，為 10.0%～57.5% ，且隨著時(shí)間的推移而增加［2-3］。PCO還影響糖尿病患者眼底檢查、視網(wǎng)膜光凝以及玻璃體手術(shù)治療效果。目前認(rèn)為PCO屬于晶狀體纖維化疾病，白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是 PCO形成的重要一環(huán)［4］。有研究顯示整合素在出現(xiàn)創(chuàng)傷后的晶狀體囊袋上有過度表達(dá)［5］，并參與了 EMT 的過程［6］，與晶狀體的纖維化疾病中成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞過度活化、增殖有關(guān)［7］。而 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)是 EMT 的表型標(biāo)志［4］，Ⅳ型膠原是PCO中EMT產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重要組成部分。因此，觀察整合素的抑制劑——去整合素對(duì) α-SMA和Ⅳ型膠原表達(dá)的影響，探討整合素在糖尿病模型中PCO形成時(shí)EMT過程中的作用機(jī)制，或許有助于糖尿病性后發(fā)性白內(nèi)障的治療。本研究建立糖尿病兔后發(fā)性白內(nèi)障模型，觀察去整合素Echistatin對(duì)糖尿病兔行晶狀體摘出術(shù)后PCO發(fā)生的最早時(shí)間(10 d)和最顯著時(shí)間(6周)［8］的干預(yù)作用，觀察其對(duì)后囊膜上 α-SMA和Ⅳ型膠原表達(dá)的影響，探討去整合素防治高血糖下PCO的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與動(dòng)物 新西蘭大白兔24只，雌雄不限，體質(zhì)量2.4～2.8 kg，眼部檢查無異常;由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)與使用均遵循視覺與眼科學(xué)研究學(xué)會(huì)(ARVO)關(guān)于動(dòng)物使用原則的規(guī)定，并且經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。去整合素 Echistatin(美國(guó) Sigma公司)，四氧嘧啶(Sigma公司)，血糖分析儀(美國(guó)強(qiáng)生)，血糖試紙條(美國(guó)強(qiáng)生)，長(zhǎng)效胰島素注射液(甘精胰島素注射液，Sanofi-Aventis Deutschland GmbH，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病兔模型的建立 將新西蘭大白兔用四氧嘧啶按100 mg·kg－1建立糖尿病兔模型，當(dāng)血糖持續(xù)2周大于12 mmol·L－1時(shí)為建模成功。對(duì)于血糖濃度高于16 mmol·L－1者，根據(jù)血糖值給予皮下注射長(zhǎng)效胰島素，使其血糖控制在12～16 mmol·L－1之間。

1.2.2 糖尿病兔后發(fā)性白內(nèi)障模型的建立及分組24只建模成功的糖尿病兔24眼(右眼)按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和 7.5 mg·L－1組、10.0 mg·L－1組，每組又隨機(jī)分為10 d和6周2個(gè)時(shí)間點(diǎn)。每只兔右眼由同一術(shù)者行透明晶狀體囊外摘出術(shù)，術(shù)畢晶狀體囊袋內(nèi)注藥0.2 mL:對(duì)照組為高壓滅菌后蒸餾水，7.5 mg·L－1組、10.0 mg·L－1組分別注射7.5 mg·L－1、10.0 mg·L－1的去整合素 Echistatin 溶液。術(shù)畢用慶大霉素地塞米松注射液結(jié)膜下注射，術(shù)后速康寧眼液和阿托品眼液滴術(shù)眼7～10 d，每天4次。夜晚涂四環(huán)素可的松眼膏，直至角膜水腫、前房滲出消失。

1.2.3 臨床觀察 術(shù)后10 d、6周分別行裂隙燈檢查PCO情況。按Odrich等［9］對(duì)PCO的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí):0級(jí)為透明;1級(jí)為輕度混濁，能看清眼底或混濁面積小于1/2后囊膜面積;2級(jí)為中度混濁，能模糊看見眼底或混濁面積大于1/2后囊膜面積;3級(jí)為完全混濁，不能看見眼底。

1.2.4 熒光定量 PCR

1.2.4.1 標(biāo)本處理 各組兔分別于術(shù)后10 d和6周空氣栓塞法處死，立即取出術(shù)眼晶狀體后囊膜速凍于－80℃冰箱，用于RT-PCR檢則。

1.2.4.2 引物 引物序列由大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)并合成，α-SMA的上游引物:5’-CCCTGAAGAACATCCAACCCTG-3’;下游引物:5’-AGCACCGCCTGAATAGCCAC-3’;Ⅳ型膠原的上游引物:5’-GGCAAGTAGATGATAAAGGCGAGA-3’;下游引物:5’-TCCCATAAAATCCATCCCAAAG-3’。內(nèi)參 GAPDH 的上游引物:5’-GAATCCACTGGCGTCTTCAC-3’;下游引物:5’-CGTTGCTGACAATCTTGAGAGA-3’。使用前將引物稀釋至10 μmol·L－1，－20℃保存。

1.2.4.3 總 RNA 的提取、逆轉(zhuǎn)錄及 RT-PCR 使用Trizol提取晶狀體后囊膜總RNA，測(cè)定RNA濃度，根據(jù)總 RNA濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，共20 μL。PCR反應(yīng)體系為20 μL，于熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:兩步法PCR擴(kuò)增，第一步:95℃ 5 min預(yù)變性;第二步擴(kuò)增:95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后立即行溶解曲線分析，程序?yàn)?95℃ 5 s，65℃ 1 min，從65℃連續(xù)升溫至97℃的過程中每隔0.5℃測(cè)定其吸光度值。最后，降溫至40℃。采用相對(duì)定量法測(cè)定目的基因PCR產(chǎn)物和GAPDH PCR產(chǎn)物的Cp值。相對(duì)定量公式:2－△△Ct，其中△△Ct= (Cp目的基因－CpGAPDH)處理組－(Cp目的基因－CpGAPDH)未處理組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)均采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，各組PCO分級(jí)眼數(shù)分布的數(shù)據(jù)資料以頻數(shù)表示，差異比較采用秩和檢驗(yàn)。各組α-SMA和Ⅳ型膠原 mRNA相對(duì)表達(dá)量的數(shù)據(jù)資料以表示，各組不同時(shí)間點(diǎn)mRNA相對(duì)表達(dá)量的總體差異比較采用方差分析，組內(nèi)多重兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn);同一時(shí)間點(diǎn)各組間比較選用LSD法單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)眼術(shù)后觀察 各組兔眼術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的角膜水腫及前房閃輝，術(shù)后3～5 d對(duì)照組及7.5 mg·L－1組基本恢復(fù)正常，10.0 mg·L－1組角膜水腫持續(xù)至7～10 d恢復(fù)正常。

2.2 晶狀體PCO分級(jí)情況 各組兔眼晶狀體囊外摘出術(shù)后10 d和6周 PCO分級(jí)情況見表1、圖1。術(shù)后10 d各組PCO程度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.090);術(shù)后6周組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)，Echistatin干預(yù)組 PCO級(jí)別明顯低于對(duì)照組，但不同濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.127)。

2.3 α-SMA mRNA表達(dá)變化 α-SMA mRNA表達(dá)變化見表2。由表2可見:不同濃度組間α-SMA mRNA表達(dá)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.989，P=0.037);從術(shù)后10 d～6周，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，α-SMA mRNA 表達(dá)增加(F=46.343，P＜0.001);Echistatin作用濃度和作用時(shí)間之間無交互作用(F交互作用=3.381，P=0.057)。術(shù)后10 d，各組間 α-SMA mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.271，P=0.769);術(shù)后6 周，7.5 mg·L－1組 α-SMA mRNA 表達(dá)低于對(duì)照組及 10.0 mg·L－1組(P=0.002、0.024)，但對(duì)照組與 10.0 mg·L－1組間 α-SMA mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.235)。與術(shù)后10 d相比，術(shù)后6周7.5 mg·L－1組 α-SMA mRNA 表達(dá)無顯著提高(P=0.054)，而對(duì)照組與 10.0 mg·L－1組 α-SMA mRNA表達(dá)均明顯高于術(shù)后 10 d(P＜0.001)，提示7.5 mg·L－1組對(duì) α-SMA mRNA 表達(dá)的抑制作用較持久穩(wěn)定。

表1 術(shù)后10 d及6周時(shí)各組PCO分級(jí)Table 1 PCO grades of each group at postoperative 10 days and 6 weeks (n=4)

Figure 1 PCO grades of each group at postoperative 6 weeks.A:Control group，grade 3;B:7.5 μg·mL－1 group，grade 0;C:10 μg·mL－1 group，grade 1 術(shù)后6周時(shí)各組 PCO分級(jí)。A:對(duì)照組 PCO 3級(jí);B:7.5 mg·L－1組 PCO 0級(jí);C:10.0 mg·L－1組 PCO 1級(jí)

表2 各組α-SMA mRNA表達(dá)變化Table 2 Expressions of α-SMA mRNA in each group (ˉx± s，n=4)

2.4 Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)變化 Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)變化見表3。由表3可見:Echistatin干預(yù)后的Ⅳ型膠原 mRNA 表達(dá)明顯下降(F=5.854，P=0.011);不同時(shí)間Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.909，P=0.353);Echistatin 作用濃度和作用時(shí)間之間無交互作用(F=2.868，P=0.083)。術(shù)后 10 d，Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);術(shù)后 6 周 7.5 mg·L－1組、10.0 mg·L－1組Ⅳ型膠原 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P=0.005、0.002)。術(shù)后6周，對(duì)照組Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)較術(shù)后 10 d 增加(P=0.025)。提示 7.5 mg·L－1和 10.0 mg·L－1Echistatin均能持久有效地抑制Ⅳ型膠原合成。

表3 各組Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)變化Table 3 Expressions of collagen typeⅣmRNA in each group (ˉx± s，n=4)

3 討論

后發(fā)性白內(nèi)障對(duì)于糖尿病患者來說除了再次降低術(shù)后視力外，還對(duì)糖尿病引起的眼后節(jié)疾病的診斷、治療造成影響，因此積極干預(yù)糖尿病患者的后發(fā)性白內(nèi)障有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。儲(chǔ)昭節(jié)等［10］實(shí)驗(yàn)證實(shí)高血糖條件下，體外培養(yǎng)人 LEC的 α-SMA、FN表達(dá)明顯高于正常血糖組，說明高濃度葡萄糖可誘導(dǎo)LEC向間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Zablocki等［11］發(fā)現(xiàn)在糖尿病相關(guān)基因轉(zhuǎn)染21 d后，小鼠晶狀體出現(xiàn)混濁，混濁斑塊上可見α-SMA、γ-crystallin等 EMT標(biāo)志的強(qiáng)陽性表達(dá)，而正常小鼠晶狀體仍保持透明，提示即使不經(jīng)過手術(shù)創(chuàng)傷炎癥的刺激，糖尿病相關(guān)基因亦可以誘導(dǎo)晶狀體發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)晶狀體混濁，由此可能造成糖尿病患者白內(nèi)障術(shù)后更易出現(xiàn)PCO。本課題組前期研究中亦發(fā)現(xiàn)［8］，與正常血糖兔相比，糖尿病兔的PCO發(fā)生率較高，LEC的增殖能力較強(qiáng)。糖尿病兔發(fā)生PCO的最早時(shí)間(10 d)和最顯著時(shí)間(6周)均較正常血糖兔(14 d、3個(gè)月)提前。

整合素是一類重要的細(xì)胞表面跨膜受體，也是ECM成分的主要受體，介導(dǎo)細(xì)胞與 ECM的相互作用。有研究表明整合素的正常表達(dá)是維持LEC正常表型的重要保障［7］。當(dāng)晶狀體受到創(chuàng)傷刺激時(shí)，整合素的異常分泌促進(jìn)了晶狀體EMT的過程，使其轉(zhuǎn)分化為有收縮功能、可表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞以及包括Ⅳ型膠原在內(nèi)的膠原合成增加，從而促進(jìn)了晶狀體纖維化疾病PCO的發(fā)展［12-13］。同時(shí)有研究表明，高血糖能夠促進(jìn)整合素β1等受體的表達(dá)增加［14］，進(jìn)而誘導(dǎo)LEC增殖和促進(jìn)上皮間質(zhì)化的轉(zhuǎn)變［7］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)對(duì)照組糖尿病兔晶狀體摘出術(shù)后后囊膜上α-SMA和Ⅳ型膠原的mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸提高。因此抑制和阻斷整合素是干預(yù)高血糖條件下PCO形成的可行方法。

本研究應(yīng)用的去整合素Echistatin對(duì)整合素αvβ3受體有特異性的抑制作用。多個(gè)研究顯示在PCO的EMT發(fā)展過程中，整合素 αvβ3起著重要的作用。伴隨著晶狀體后囊膜上腱糖蛋白、玻連蛋白及纖連蛋白等ECM的異常增生，其受體整合素αv與多種 β 亞基組成的二聚體 αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6出現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)，提示αv與晶狀體纖維化疾病發(fā)生過程中 EMT 的過程有密切的關(guān)系［7］。Galliher等［15］發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3通過調(diào)控其下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)受體促進(jìn) EMT的發(fā)生，當(dāng)整合素 β3缺乏時(shí)，TGF-β 無法誘導(dǎo)出EMT［15］。而在PCO發(fā)展過程中EMT所必需的Src激酶活化也被認(rèn)為是依賴αvβ3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)完成的［7］。這些均提示αvβ3在EMT過程中的關(guān)鍵作用。因此阻斷整合素αvβ3受體是抑制EMT的有效途徑。

朱玉廣等［16］使用去整合素 Kistrin(整合素 αvβ3拮抗劑)可抑制TGF-β2誘導(dǎo)的體外人 LEC的 EMT過程。Shah等［17］研究也發(fā)現(xiàn)去整合素 Echistatin通過阻斷整合素αvβ3和FAK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了EMT的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示7.5 mg·L－1和10.0 mg·L－1去整合素Echistatin在術(shù)后遠(yuǎn)期有效抑制了糖尿病兔PCO的發(fā)生和發(fā)展。進(jìn)一步探索其對(duì)EMT的影響發(fā)現(xiàn)，雖然 7.5 mg·L－1和 10.0 mg·L－1去整合素 Echistatin對(duì)早期(10 d)α-SMA及Ⅳ型膠原mRNA的表達(dá)均無明顯干預(yù)效果，但遠(yuǎn)期抑制作用頗為顯著。術(shù)后6周7.5 mg·L－1去整合素Echistatin明顯抑制 α-SMA mRNA的表達(dá)，其表達(dá)與10 d無顯著差異。但我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)更高濃度的10.0 mg·L－1組卻未出現(xiàn)更強(qiáng)的抑制作用，其術(shù)后6周α-SMA mRNA的表達(dá)量是10 d的3.6倍，抑制作用與對(duì)照組無明顯差異。其原因可能是當(dāng)高濃度去整合素應(yīng)用于眼內(nèi)時(shí)，短期內(nèi)對(duì)眼內(nèi)組織如角膜及虹膜等產(chǎn)生較明顯毒性作用，破壞了術(shù)眼的血-房水屏障，且炎癥介質(zhì)釋放、補(bǔ)體激活，以及一些細(xì)胞因子的釋放均可刺激EMT的發(fā)生，導(dǎo)致α-SMA表達(dá)反而增高。而 7.5 mg·L－1和10.0 mg·L－1Echistatin 則均顯示出對(duì)Ⅳ型膠原明顯的抑制作用，并在術(shù)后晚期保持了較穩(wěn)定的抑制效果，提示Echistatin能在較大的濃度范圍內(nèi)對(duì)Ⅳ型膠原合成有持久的抑制作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示去整合素Echistatin可有效抑制糖尿病兔晶狀體摘出術(shù)后晶狀體后囊膜上α-SMA和Ⅳ型膠原的mRNA表達(dá)，減少EMT發(fā)生和膠原合成，從而抑制PCO的發(fā)生發(fā)展。

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