固本抑瘤Ⅲ號(hào)方聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌裸鼠異位移植瘤的抑瘤作用

劉炬，錢海利，徐志堅(jiān)，張立生，葉霈智，田愛平，楊宏麗

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，腫瘤研究所，1.防癌科，2.分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.中醫(yī)科，北京 100021)

胰腺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，也是常見實(shí)體瘤中預(yù)后最差的惡性腫瘤。隨著人們生活水平的提高，胰腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。雖然上個(gè)世紀(jì)80年代以來(lái)，各種常見實(shí)體瘤的治療都取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但胰腺癌的治療水平無(wú)明顯的提高。一項(xiàng)國(guó)際多中心臨床研究代表了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療胰腺癌的療效:靶向治療藥物特羅凱聯(lián)合化療藥物吉西他濱治療不能手術(shù)的胰腺癌患者，中位生存期僅由吉西他濱治療的5.9個(gè)月延長(zhǎng)至6.4個(gè)月［1］。因此，迫切需要探索新的治療思路和方法。

固本抑瘤Ⅲ號(hào)方是郁仁存主任醫(yī)師治療惡性腫瘤的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用，證明其治療常見癌癥具有提高患者免疫力、改善患者生活質(zhì)量的作用［2，3］。因此，嘗試應(yīng)用于胰腺癌動(dòng)物模型研究。雖然觀察藥物臨床療效最直接的辦法是進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但由于患者之間的個(gè)體差異大、影響臨床療效的因素多等原因使臨床藥物療效評(píng)價(jià)研究即臨床試驗(yàn)花費(fèi)巨大且耗時(shí)較長(zhǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究周期短，可以設(shè)各種不同治療組，恰好能夠彌補(bǔ)臨床研究的缺欠，能夠在較短時(shí)間內(nèi)得出一定的療效結(jié)論，為臨床研究和治療提供有意義的線索和依據(jù)［4］。

裸鼠是免疫缺陷小鼠，人源性腫瘤細(xì)胞能夠在其體內(nèi)生長(zhǎng)，人惡性腫瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤模型能夠較好地反應(yīng)藥物對(duì)人體癌癥的治療效果［5］。

因此，采用裸鼠人胰腺癌移植瘤模型探索固本抑瘤Ⅲ號(hào)方以及其與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)裸鼠人胰腺癌移植瘤的抑瘤作用，以期指導(dǎo)臨床實(shí)踐，提高臨床胰腺癌的治療水平。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 人胰腺癌細(xì)胞株

采用PANC-1細(xì)胞株，凍存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所藥檢中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)BALB/c-nu裸小鼠40只，6周齡，雄性，體重17～18.5 g，來(lái)源于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009-0004】。無(wú)菌手術(shù)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(京)2008-0025】超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.3 藥品

吉西他濱(商品名:健擇)，美國(guó)禮來(lái)公司生產(chǎn)，批號(hào):A731260A，以生理鹽水配制成4 mg/mL溶液，每次給藥前配制。固本抑瘤Ⅲ號(hào)方:生黃芪30 g、太子參30 g、白術(shù) 10 g、茯苓 10 g、女貞子 10 g、枸杞子 10 g、山萸肉 10 g、白英 20 g、龍葵 15 g、蛇莓 15 g、雞內(nèi)金 10 g、土茯苓 30 g、草河車10 g、雞血藤30 g、焦三仙30 g。以上中藥采用廣州一方制藥廠生產(chǎn)的免煎顆粒，顆?；靹蚝螅扛稖幖蛹儍羲渲瞥?0 mL中藥湯劑，每毫升湯劑相當(dāng)于生藥3 g。中藥復(fù)方灌胃給藥，每日1次，每次0.5 mL。按每千克體重計(jì)算約相當(dāng)于臨床用藥劑量的16倍。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 接種及分組方法

將凍存的PANC-1細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)，接種于裸鼠右腋下，連續(xù)傳代3代后，當(dāng)?shù)?代移植瘤生長(zhǎng)至3周時(shí)，處死荷瘤裸鼠，取新鮮瘤組織，切成體積約8 mm3瘤塊，接種于實(shí)驗(yàn)裸鼠右側(cè)腋下，以上操作全部于超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下進(jìn)行。移植后第8天腫瘤于局部成活并生長(zhǎng)至直徑約0.5 cm，將動(dòng)物隨機(jī)分組為4組:對(duì)照組、吉西他濱組、固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合吉西他濱組、固本抑瘤Ⅲ號(hào)組，每組10只裸鼠。

1.2.2 給藥方式

自接種第8天起對(duì)各組給予不同治療，①對(duì)照組每日灌胃給藥0.5 mL純凈水，于吉西他濱組進(jìn)行腹腔注射的同日，每周兩次腹腔注射生理鹽水0.5 mL。②吉西他濱組按照100 mg/kg劑量，以生理鹽水配制成4 mg/mL，每周2次腹腔注射給藥。③固本抑瘤Ⅲ號(hào)組為口服給藥，每日1次，每次0.5 mL，共給藥22 d。④固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合化療組每日灌胃給藥0.5 mL固本抑瘤Ⅲ號(hào)湯藥，同時(shí)按照100 mg/kg每周2次腹腔注射吉西他濱。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 抑瘤率

接種后第30天，安樂(lè)死全部裸鼠，分離移植瘤，稱瘤重，抑瘤率=(對(duì)照組瘤重-治療組瘤重)/對(duì)照組瘤重 ×100%。

1.3.2 移植瘤體積

自第8天開始治療起，每周兩次于吉西他濱給藥前用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組移植瘤的長(zhǎng)徑和短徑，腫瘤體積V=0.5×長(zhǎng)徑 ×短徑 ×短徑(mm3)。

1.3.3 裸鼠體重

自接種后第8天起，每周兩次測(cè)量裸鼠的體重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 11.0。

2 結(jié)果

2.1 各組瘤重及抑瘤率

各組平均瘤重及抑瘤率詳見表1。吉西他濱組平均瘤重明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合吉西他濱治療組抑瘤率進(jìn)一步提高達(dá)68.9%，與對(duì)照組比差異有顯著性(P＜0.01)，與吉西他濱組比差異有顯著性(P＜0.05)，中藥復(fù)方固本抑瘤Ⅲ號(hào)增加了吉西他濱抑制移植瘤生長(zhǎng)的作用。單純固本抑瘤Ⅲ號(hào)治療組抑瘤率為28.0%，表現(xiàn)出一定的抑瘤作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 體積的變化

各組體積的變化請(qǐng)見表2。接種后對(duì)照組腋下移植瘤體積增長(zhǎng)迅速，其余各組移植瘤體積增長(zhǎng)均受到了一定程度的抑制。接種時(shí)間越長(zhǎng)，各治療組抑制移植瘤生長(zhǎng)作用越明顯。接種后第22天，固本抑瘤Ⅲ號(hào)組、吉西他濱組以及固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合吉西他濱組移植瘤體積明顯低于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)，接種后第27天，固本抑瘤Ⅲ號(hào)組、吉西他濱組以及固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合吉西他濱組移植瘤體積明顯低于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)。接種后30 d，吉西他濱組移植瘤體積明顯低于對(duì)照組(P＜0.001)，固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合吉西他濱組體積明顯小于對(duì)照組(P＜0.0001)。

表1 各組裸鼠瘤重抑瘤率的比較(±s，n=10)Tab.1 Inhibition rate of the tumor mass in the four groups

表1 各組裸鼠瘤重抑瘤率的比較(±s，n=10)Tab.1 Inhibition rate of the tumor mass in the four groups

注:*:與對(duì)照組比P＜0.05，＊＊:與對(duì)照組比P＜0.01，#:與吉西他濱組比P＜0.05。Note:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，vs.control group.#P ＜0.05，vs.gemcitabine group.

組別Groups瘤重/g Tumor mass/g抑瘤率/%Inhibition rate對(duì)照組Control 1.32±0.65 -吉西他濱組Gemcitabine 0.67±0.29* 49.2固本抑瘤Ⅲ號(hào)組Guben Yiliu 0.95±0.41 28.0 68.9固本加吉西他濱組Guben+Gem 0.41 ±0.24＊＊#

表2 各組治療后裸鼠移植瘤體積的比較(±s，mm3)Tab.2 The volume of transplanted tumors in the four groups after treatment

表2 各組治療后裸鼠移植瘤體積的比較(±s，mm3)Tab.2 The volume of transplanted tumors in the four groups after treatment

注:*:與對(duì)照組比 P ＜0.05，＊＊:與對(duì)照組比 P ＜0.01，＊＊＊:與對(duì)照組比 P ＜0.001，＊＊＊＊:P ＜0.0001。Note:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001，＊＊＊＊P ＜0.0001，vs.control group.

組別groups 8 d 12 d 15 d 18 d 22 d 27 d 30 d對(duì)照組Control 79.7±31.2 91.4±49.7 232.3±109.0 407.3±211.0 706.0±237.3 1112.4±346.8 1441.3±442.5吉西他濱組Gemcitabine 81.9±27.8 99.0±65.2 169.4±84.72 249.9±118.5 420.3±151.2* 680.0±177.0＊＊ 809.4±177.8＊＊＊固本抑瘤Ⅲ號(hào)組Guben Yiliu 78.7±16.7 79.7±81.3 161.5±92.9 250.7±165.6 377.8±224.7＊＊ 720.0±399.5* 1006.4±489.6固本加吉西他濱組Guben+Gem 80.1±25.0 115.3±78.7 244.5±125.5 318.7±198.5 399.1±201.6＊＊ 582.5±280.7＊＊ 694.3±328.1＊＊＊＊

2.3 治療的副作用

2.3.1 腹瀉

實(shí)驗(yàn)期間各組裸鼠均存活，固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合吉西他濱組、吉西他濱組均有一只裸鼠出現(xiàn)腹瀉，2 d后恢復(fù)。

2.3.2 體重的變化

治療前各組之間體重沒(méi)有明顯差別，開始治療捒，聯(lián)后治療組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，體重均明顯于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在接種后第15天、18天、30天，聯(lián)合治療組體重低于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吉西他濱治療組、固本抑瘤Ⅲ號(hào)組裸鼠體重與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(表3)。

表3 治療后裸鼠體重的變化(±s，g)Tab.3 Changes of body weight of the mice in the 4 groups after treatment

表3 治療后裸鼠體重的變化(±s，g)Tab.3 Changes of body weight of the mice in the 4 groups after treatment

注:*:與對(duì)照組比P＜0.05，＊＊:與對(duì)照組比P＜0.01，＊＊＊:與對(duì)照組比P＜0.0001，#:與吉西他濱組比 P＜0.05，##:與吉西他濱組比 P＜0.01，＆:與固本抑瘤組比 P ＜0.05。Note:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.0001，vs.control group.#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs.gemcitabine group. ＆P ＜0.05，vs.Guben Yiliu group.

組別Groups 8 d 12 d 15 d 18 d 22 d 27 d 30 d對(duì)照組Control 19.6±1.1 20.7±1.0 21.2±1.3 22.4±1.6 22.5±1.5 23.6±1.6 23.9±1.6吉西他濱組Gemcitabine 19.1±0.7 20.5±0.5 21.0±0.8 21.7±1.1 21.8±1.3 22.9±1.1 22.8±1.0固本抑瘤Ⅲ組Guben Yiliu 19.3±0.8 20.2±1.0 21.2±1.4 22.4±1.9 22.9±1.7 22.7±2.0 23.0±1.9固本加吉西他濱組Guben+Gem 19.2 ±0.8 19.0 ±0.6＊＊＊ 19.6 ±1.7*#＆ 20.5 ±1.0＊＊#＆20.8 ±1.3*＆ 22.0 ±1.2* 21.1 ±1.1＊＊＊##＆

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用先天性免疫缺欠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸鼠按臨床應(yīng)用情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組，探討了固本抑瘤Ⅲ號(hào)方及其與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)裸鼠人胰腺癌移植瘤的抑瘤作用。

裸鼠因?yàn)槿狈π叵?，不具備T細(xì)胞免疫力，故對(duì)異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。與人胰腺癌裸鼠原位移植癌相比，皮下種植的異位移植瘤模型具有移植成功率高且易于觀察療效和實(shí)施治療的優(yōu)點(diǎn)［5］。

在動(dòng)物移植瘤抑瘤率觀察上，抑瘤率是最重要的觀察指標(biāo)。由于移植瘤質(zhì)量能夠得到精確的測(cè)量，而移植瘤體積因?yàn)樾螤钜话悴灰?guī)則難以得到準(zhǔn)確的測(cè)量，所以采用移植瘤質(zhì)量的抑瘤率較移植瘤體積指標(biāo)能夠更精確地反映藥物治療的抑瘤作用。

中藥或者中藥復(fù)方治療人胰腺癌裸鼠移植瘤的研究報(bào)告較少。中藥復(fù)方清胰化積方的研究采用人胰腺癌SW1990細(xì)胞移植瘤進(jìn)行了研究，清胰化積中藥移植瘤質(zhì)量抑瘤率為21.3% ～38.2%，與固本抑瘤Ⅲ號(hào)方接近。研究認(rèn)為調(diào)節(jié)癌基因及其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)、改變腫瘤細(xì)胞蛋白合成等可能為作用機(jī)制，研究未設(shè)中藥與化療聯(lián)合治療組［6］。另一篇文章報(bào)告采用人胰腺癌SW1990細(xì)胞移植瘤模型發(fā)現(xiàn)中藥成分大黃素與吉西他濱聯(lián)合能夠增強(qiáng)吉西他濱的抑瘤作用，機(jī)制在于促進(jìn)SW1990細(xì)胞中Bax的表達(dá)和抑制Bcl-2的表達(dá)，研究采用的抑瘤率是移植瘤體積而非移植瘤質(zhì)量［7］。一項(xiàng)采用人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤進(jìn)行華蟾素的研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素的抑瘤作用機(jī)制可能與IL-6、IL-8、s-VCAM-1等細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)有關(guān)［8］。中藥合劑“振明正生”對(duì)裸鼠人胰腺癌P3移植瘤生長(zhǎng)有一定的抑制作用，觀察指標(biāo)為移植瘤體積，給藥時(shí)間為接種后24 h［9］。接種后開始給藥時(shí)間越晚，抑瘤作用的強(qiáng)度要求越高。

本實(shí)驗(yàn)中，吉西他濱治療組有明顯的抑瘤作用，抑瘤率為49.2%，裸鼠移植瘤模型證實(shí)了吉西他濱治療的有效性，與臨床研究結(jié)果一致［10］，說(shuō)明裸鼠人胰腺癌移植瘤模型能夠較好地反映臨床上胰腺癌治療的療效。

研究中，固本抑瘤Ⅲ號(hào)顯示了一定的抑瘤作用，抑瘤率28.0%，從移植瘤體積上看，在接種后第22天和27天，體積明顯低于對(duì)照組，差異有顯著意義。同時(shí)，固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合吉西他濱組抑瘤率為68.9%，較單純吉西他濱化療組高。以上結(jié)果說(shuō)明中藥復(fù)方固本抑瘤Ⅲ號(hào)具有一定的抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且與吉西他濱的抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用具有一定的協(xié)同作用。

體重能夠反應(yīng)治療期間的副作用。從體重?cái)?shù)據(jù)可以看出，吉西他濱組治療后裸鼠體重的增加受到一定程度的抑制。與對(duì)照組比，固本抑瘤Ⅲ號(hào)組體重下降不明顯。值得注意的是固本抑瘤Ⅲ號(hào)聯(lián)合吉西他濱治療組體重下降明顯，較其他3組均有明顯的下降(表3)。這一現(xiàn)象說(shuō)明固本抑瘤Ⅲ號(hào)與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用可能有一定的協(xié)同副作用。即固本抑瘤Ⅲ號(hào)增加了吉西他濱化療的療效，同時(shí)也增加了吉西他濱化療的副作用。單純固本抑瘤Ⅲ號(hào)治療有一定的抑瘤作用，沒(méi)有明顯的導(dǎo)致體重下降的副作用。在臨床應(yīng)用中，患者的化療周期較長(zhǎng)，化療用藥時(shí)間較短，需要根據(jù)患者的身體狀況、化療副反應(yīng)的輕重、對(duì)化療的耐受性等對(duì)固本抑瘤Ⅲ號(hào)進(jìn)行加減，以充分利用固本抑瘤Ⅲ號(hào)增加療效的作用，避免其增加吉西他濱化療的副作用。另外，在化療的間期以及不進(jìn)行化療期間，采用固本抑瘤Ⅲ號(hào)治療也能夠起到一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，這一點(diǎn)已通過(guò)初步的臨床觀察證實(shí)。

固本抑瘤Ⅲ號(hào)方是郁仁存主任醫(yī)師治療常見惡性腫瘤的經(jīng)驗(yàn)方，體現(xiàn)了治療惡性腫瘤扶正固本、袪邪的治則，方中同時(shí)也體現(xiàn)了益氣活血、清熱解毒的用藥特點(diǎn)。應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、胰腺癌等常見的惡性腫瘤的治療均起到了非常好的扶正、固本、抑瘤、延長(zhǎng)生存期的作用［2，3］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中也顯示了較好的療效［11］。方中主要由補(bǔ)氣活血藥，健脾補(bǔ)腎、清熱解毒藥物組成。全方攻補(bǔ)結(jié)合，因此在單純固本抑瘤Ⅲ號(hào)治療組未顯示出明顯的副作用但卻有一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。在聯(lián)合治療組，由于化療藥物吉西他濱的強(qiáng)大的“攻”的作用，在整個(gè)治療中固本抑瘤Ⅲ號(hào)方中補(bǔ)的力量明顯不足，因此，出現(xiàn)了明顯的體重下降。臨床上，吉西他濱加固本抑瘤Ⅲ號(hào)治療適合于一般情況好的患者。而對(duì)于一般情況差的患者，可以采用固本抑瘤Ⅲ號(hào)方加減治療。

胰腺癌是目前腫瘤治療面臨的最大的難題之一，短時(shí)間內(nèi)很難有重大的突破，而中醫(yī)藥治療是非常值得探討的領(lǐng)域。臨床實(shí)踐和初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示中藥復(fù)方固本抑瘤Ⅲ號(hào)方治療有一定的化療增效作用。下一步的研究應(yīng)該進(jìn)行中藥拆方研究以及可能有效的中藥的抑瘤作用研究，從而發(fā)現(xiàn)更好的方劑組成原則以及更有效的中藥，進(jìn)一步提高中醫(yī)以及中西醫(yī)集合臨床治療胰腺癌的水平。

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