PCR-測序法對嚙齒類動物漢坦病毒的檢測和基因分型

戴方偉，宋曉明，盧領(lǐng)群，周莎桑，薩曉嬰，呂宇，應(yīng)華忠

(1浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，杭州 310013;2杭州師范大學(xué)實驗動物中心，杭州 310036)

漢坦病毒(Hantavirus，HV)屬布尼亞病毒科，是一種有包膜分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，包括引起漢坦病毒腎綜合征出血熱(HFRS)的漢坦型、漢城型、普馬拉型等，以及引起漢坦病毒肺綜合征(HPS)的紐約型、無名型等，在我國以漢坦型和漢城型為主要流行株［1］。自然宿主以小型嚙齒動物為主，并經(jīng)由嚙齒類動物傳染給人類，引起HFRS或HPS等［2］，因此從事實驗動物生產(chǎn)及科學(xué)研究人員存在接觸攜帶HV的宿主動物及其排泄物、污染的塵埃等而被感染的風(fēng)險。由于HV引發(fā)疾病的類型及其嚴(yán)重程度取決于病毒的型別，對漢坦病毒株的分型，以及闡明病毒之間的關(guān)系對HV病原防治具有重要的意義［3-4］。

實驗動物漢坦病毒的檢測有血清檢測和基因檢測兩種，目前血清檢測是漢坦病毒檢測的主要方法。該法雖能用于漢坦病毒分型，但存在實驗周期長、工作量大等問題。已有研究表明，依據(jù)M基因片段上部分核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分型結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果一致［5］?；诓《净蛐蛄袛?shù)據(jù)分析不但能對病毒進(jìn)行基因分型，而且也能較好地反映病毒間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。本研究根據(jù)GenBank中部分有代表性的毒株基因S片段序列設(shè)計引物，采用鄰位相連法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以此方法對浙江省近年從野生嚙齒類動物中臨床分離的漢坦病毒毒株進(jìn)行分型鑒定，旨在探討適合實驗動物漢坦病毒基因分型和種系發(fā)生重建的分子生物學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購自美國Qiagen公司;克隆載體、T4連接酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA Taq酶、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)相關(guān)試劑、瓊脂糖凝膠純化試劑盒及質(zhì)粒DNA純化試劑盒購自日本TaKaRa中國分公司。引物合成由上海生工生物工程公司完成。HV直接熒光抗血清和HV單克隆熒光抗體均由浙江省腎綜合征出血熱重點實驗室提供。

1.2 分析用漢坦病毒株

24株HV代表株序列下載自Genbank數(shù)據(jù)庫，包括7種血清亞型，詳細(xì)信息見表1［5］。

表1 24株HV代表株的信息Tab.1 The information of 24 representative hantavirus strains

本研究選取11株HV實驗毒株進(jìn)行系統(tǒng)分析， 這11株HV實驗毒株分別為:天77-2、游10-31、泉547、龍泉、游 10-30、R88、N1、N2、N3 以及 1 株漢城病毒標(biāo)準(zhǔn)株N4(UR，SEO血清型)和1株HV標(biāo)準(zhǔn)株T8(76-118，HTN血清型)。上述實驗毒株中，N4和 T8為陽性對照，同時采用了肺440、肺473、471、97這4個臨床檢測陰性樣本的DNA作為陰性對照。所有病毒DNA樣本及血清學(xué)鑒定信息均由浙江省腎綜合征出血熱重點實驗室提供。毒株信息詳見表2。

表2 研究中用于系統(tǒng)發(fā)生分析的HV株鑒定及其來源信息Tab.2 Identification and sources of hantavirus used for the phylogenetic analysis in the present study

1.3 引物設(shè)計

S片段的擴增引物參考已知HV株的核苷酸序列，本實驗室自行設(shè)計并由上海生物工程公司合成，引物序列為上游引物:ATTAGCCCWGTCATGAGTGT，下游引物:CTTTGACTCYTTTGKYTCCA，擴增產(chǎn)物長度201 bp。

1.4 RT-PCR擴增

利用引物對上述病毒株進(jìn)行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物的克隆及篩選方法見文獻(xiàn)［6］。具體步驟如下:

1.4.1 提取病毒總RNA

根據(jù)Qiagen的RNA提取試劑盒說明書操作。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄

以提取的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為:模板 RNA(約 500 ng)1 μL，Random primers(25 μmol/L)1 μL，DEPC 水4 μL;70℃保溫10 min，迅速置冰浴2 min;再加入:5× MMLV buffer 2 μL，dNTP mix(10 mmol/L)0.5 μL，RNase inhibitor(40 U/μL)0.25 μL，RTase MMLV(200 U/μL)0.5 μL，DEPC 水 0.75 μL;總體積為 10 μL。反應(yīng)條件為:30℃保溫10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min。反應(yīng)結(jié)束后，迅速置于冰上冷卻，-20℃保存?zhèn)溆?以上所有操作均在冰上進(jìn)行)，獲得cDNA。

圖1 24株HV代表株S片段引物設(shè)計區(qū)基因的分型結(jié)果Fig.1 Genotyping results of S segments of 24 representative strains of hantavirus

1.4.3 PCR擴增

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用上述設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系為:模板0.5 μL，10× PCR buffer(含 Mg2+)2 μL，MgCl2(終濃度 2.5 mmol/L)2 μL，dNTP(終濃度 75 μmol/L)0.15 μL，Taq酶(0.75 U)0.15 μL，正反向引物(終濃度0.25 μmol/L)各0.5 μL，DEPC 水補足至20 μL 體系。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴增30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物電泳驗證后，回收目的片段。

圖2 各病毒樣本的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis map of PCR products from virus samples isolated from wild rodents in Zhejiang Province

1.5 核苷酸序列測定和分析

核苷酸序列測定由上海生物工程公司完成，將測定的序列結(jié)果應(yīng)用DNA STAR軟件(SeqMan)進(jìn)行拼接，應(yīng)用CLUSTALW軟件進(jìn)行多序列聯(lián)配，并MEGA 4.0軟件包進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，以鄰位相連法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 利用目標(biāo)序列構(gòu)建代表株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 24株HV代表株和11株實驗毒株S片段引物設(shè)計區(qū)基因的分型結(jié)果Fig.3 Genotyping results of S segments of 24 representative strains and 11 wild-isolated strains of hantavirus

24株HV代表株的S片段序列均來自Gen-bank，通過BLASTN確定目標(biāo)序列區(qū)域，經(jīng)多序列聯(lián)配后，通過MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法)。該系統(tǒng)發(fā)育樹將所分析的毒株分為5個區(qū)域，即引起腎綜合征出血熱HTN、SEO、DOB、PUU血清型、以及引起漢坦病毒肺綜合征的Sin Nombre血清族(AND，BAY，SNV)(圖1)。引起HFRS的四種血清型具有較穩(wěn)定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，且能與引起HPS的血清型進(jìn)行區(qū)分。其中PUU血清型的毒株與引起HPS的HV具有更近的進(jìn)化距離。引起HPS的三種血清型親緣關(guān)系較近，其中AND血清型與BAY和SNV的差異較大，而后二者雖然形成較獨立的分區(qū)，但自展值較小(＜50)。

2.2 實驗毒株的檢測和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用本文設(shè)計的引物對實驗毒株進(jìn)行PCR擴增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該引物在11株實驗毒株(含陽性對照T8和N4)中擴增結(jié)果均為陽性，且產(chǎn)物大小與目標(biāo)區(qū)域一致，而陰性對照組中沒有條帶(圖2)。由此表明本引物對HV的檢測具有很好的敏感性和特異性。PCR產(chǎn)物隨后進(jìn)行測序和拼接，并加入24株代表株的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(圖3)。結(jié)果表明系統(tǒng)發(fā)育分析將已知血清型的T8毒株分為HTN分支，N4毒株分為SEO血清型，另外9株血清型不明的毒株分為4個血清型，其中天77-2、游10-31和龍泉為HTN血清型，N1為SEO血清型;而其余5個毒株則形成較為獨立的兩個分支，即(N2，N3)和(泉547，游10-30，R88)，這兩個分支之間親緣關(guān)系較近，且與本文選取的5個代表性血清型具有較大的差異。

3 討論

PCR技術(shù)具有周期短，耗費少且敏感性、特異性高等優(yōu)點，在臨床檢驗和生物安全等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。國外大型實驗動物機構(gòu)在實施實驗動物質(zhì)量監(jiān)測和病原體診斷中，均將基于PCR的分子生物學(xué)檢測方法作為首選手段。在HV的檢測中，PCR方法可比血清學(xué)抗體方法早5～15 d檢測到陽性結(jié)果［7］。本文報道了針對HV S片段進(jìn)行檢測的引物，系統(tǒng)發(fā)育分析表明該引物的目標(biāo)區(qū)域可對已知的代表株進(jìn)行準(zhǔn)確的分型。此前的研究報道S片段構(gòu)建的進(jìn)化樹不能準(zhǔn)確區(qū)分SEO和DOB兩種血清型［5］。本文的分析觀察到SEO和DOB血清型有更近的親緣關(guān)系，但目標(biāo)片段的系統(tǒng)發(fā)育分析能對其進(jìn)行較好的分類。

本文同時利用所設(shè)計引物對浙江省現(xiàn)有的11株HV進(jìn)行了分型檢測，結(jié)果表明該引物具有高度的敏感性和特異性，提示其具有用以臨床檢測HV的價值。由于HV的自然宿主主要是小型嚙齒類動物，經(jīng)由排泄物、唾液、直接接觸或蟲媒等傳染人，因此對嚙齒類動物的HV進(jìn)行快速檢測和分型將有助于HV流行病學(xué)調(diào)查和感染控制等后續(xù)處置工作。本研究所使用毒株均為浙江省各地近幾年從野生嚙齒類動物上分離的臨床毒株，具有一定的地域代表性。對其中9株嚙齒類動物分離獲得的血清型未知毒株的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其包含引起HFRS的HTN(3株)和SEO(1株)血清型，其他5株HV屬于兩種未知血清型。下一步我們將對這5株病毒株進(jìn)行全基因組的分型測序，以探討說明是否存在毒株變異的情況。

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