酶的固定化技術(shù)及其應(yīng)用

王冰,張榮華

（哈藥集團(tuán)技術(shù)中心，黑龍江哈爾濱150025）

將原來呈水溶性的酶通過物化方式處理后，使其與固態(tài)的水不溶性支持物結(jié)合或被載體包埋的酶處理方式稱為酶的固定化技術(shù)。傳統(tǒng)的酶固定化法可以分為4種，即包埋法、交聯(lián)法、吸附法和載體偶聯(lián)法[1]。近年來，對(duì)固定化酶的研究領(lǐng)域主要集中在探索延長(zhǎng)固定化酶的半衰期、降低成本、提高酶的活性收率等新的酶固定化技術(shù)方面。

1 傳統(tǒng)酶固定化法的分類

1.1 包埋法

將酶與載體混合，借助引發(fā)劑使二者進(jìn)行聚合反應(yīng)，然后通過物理作用把酶限制在載體的網(wǎng)格之中來實(shí)現(xiàn)酶固定化的方法叫做包埋法。這種方法由于沒有涉及到酶分子的化學(xué)變化和酶的構(gòu)象，而且反應(yīng)條件非常溫和，因此酶活的回收率比較高。這種方法形成的固定化酶缺點(diǎn)是容易漏失，常常存在擴(kuò)散限制的問題，因而不適合反應(yīng)底物為大分子的催化反應(yīng)。

1.2 交聯(lián)法

利用多功能或者雙功能交聯(lián)劑，在交聯(lián)劑和酶分子之間形成共價(jià)鍵，在交聯(lián)體系中加入不同材料以及采用不同交聯(lián)條件來產(chǎn)生物理性質(zhì)各不相同的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。交聯(lián)法的缺點(diǎn)是可能使酶的活性降低，并且交聯(lián)劑的價(jià)格比較昂貴，因此交聯(lián)法一般不單獨(dú)使用，而是將這一方法做為其他固定化法的輔助方式[2]。

1.3 吸附法

吸附法包括離子交換吸附法和物理吸附法。吸附法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)酶催化活性的影響小、酶的構(gòu)象變化?。蝗秉c(diǎn)是載體和酶之間的結(jié)合力弱，在不適合的pH和離子強(qiáng)度條件下或者高鹽濃度和高溫的條件下，酶極易從載體上脫落下來，導(dǎo)致催化活力的降低甚至喪失和污染催化反應(yīng)產(chǎn)物等。因此，吸附法雖然是最早出現(xiàn)的方法，但應(yīng)用受到限制。

1.4 載體偶聯(lián)法

載體偶聯(lián)法又稱共價(jià)結(jié)合法[3]，是指載體表面的功能活性基團(tuán)與酶分子表面的基團(tuán)通過形成共價(jià)健來實(shí)現(xiàn)不可逆結(jié)合的酶固定化法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是所得到的固定化酶與載體結(jié)合的非常牢固，有極好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，是最為常見的方法。

2 新型酶固定化方法

2.1 酶的定向固定化

將酶與載體在任意位點(diǎn)進(jìn)行連接的方法是傳統(tǒng)的固定化酶的方法，但是這種方法往往由于酶的活性位點(diǎn)得不到充分的暴露，而存在使酶的固定化量降低的缺陷。因此，定向化固定酶的技術(shù)成為了今后研究的熱點(diǎn)。這一方法適用于容易接近酶活位點(diǎn)的大分子底物。

2.2 新型載體固定化酶

載體的性能對(duì)固定化酶有著較大的影響。物理和化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定、抗微生物降解的性能、較高的結(jié)合能力以及較好的機(jī)械強(qiáng)度等特性都是理想的載體所要具備的條件。天然的無機(jī)或有機(jī)材料、進(jìn)行了改性設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)載體、高分子合成載體材料和高分子復(fù)合物等都屬于新型載體。其中高分子復(fù)合物是指兩種或多種不同性質(zhì)的高分子體系聚集在一起而形成的一些具有特殊功能的一種新型載體。運(yùn)用高新技術(shù)手段來研究設(shè)計(jì)新型載體，從而對(duì)傳統(tǒng)的固定化技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，是固定化酶今后發(fā)展的趨勢(shì)。

3 固定化酶的性質(zhì)

一般認(rèn)為有兩種原因會(huì)使固定化酶性質(zhì)發(fā)生改變，一種是由于酶本身活性中心的氨基酸殘基改變、高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化和帶電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化；另一種是受載體的物化性質(zhì)的影響，主要體現(xiàn)在載體的周圍形成了能對(duì)固定化酶產(chǎn)生影響的擴(kuò)散層和靜電荷相互作用而引起的變化。酶性質(zhì)的改變一般表現(xiàn)在溫度、穩(wěn)定性和pH值上。酶固定化后的最適溫度比一般的天然酶大致會(huì)提高5-10℃；酶固定化后的穩(wěn)定性會(huì)有所提高；酶固定化后的最適pH活性曲線有時(shí)會(huì)變化，有時(shí)則不會(huì)。

4 固定化酶的應(yīng)用

4.1 固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

固定化酶最大的應(yīng)用是用于工業(yè)生產(chǎn)。1972年產(chǎn)生的固定化葡萄糖異構(gòu)酶是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶，這種固定化酶可以用來催化玉米糖漿，使其生產(chǎn)高甜度的高果糖糖漿。今年來，經(jīng)過科學(xué)家們不斷的研究，從鏈霉菌和芽孢桿菌中提取到的葡萄糖異構(gòu)酶已經(jīng)被成功固定，并且大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。在今后的幾十年中，無論是國內(nèi)市場(chǎng)還是國外市場(chǎng)，固定化葡萄糖異構(gòu)酶無疑都將是市場(chǎng)份額最大而且應(yīng)用最廣泛的固定化酶。

4.2 固定化酶在臨床醫(yī)療中的應(yīng)用

近年來，由酶學(xué)發(fā)展出來的酶療法已經(jīng)廣泛地在醫(yī)藥醫(yī)療方面得到應(yīng)用。但是，酶作為藥物用于治療目的來講，它的缺點(diǎn)也是顯而易見的。由于酶是一種活力較低的蛋白質(zhì)，本身不穩(wěn)定，因此很容易被蛋白酶水解成多肽而失去治療效果。而且酶進(jìn)入人體后會(huì)使人產(chǎn)生抗體，而這種抗體反應(yīng)嚴(yán)重的話則會(huì)導(dǎo)致病患的過敏性休克。但是如果可以先將固定化酶做成微小的膠囊型，再注入到體內(nèi)，就可以增加其自身的穩(wěn)定性，并且能夠避免與人體的體液相接觸導(dǎo)致產(chǎn)生抗體。而且這種微膠囊可以生物降解，具有良好的生物相容性，避免了長(zhǎng)期存留在人體內(nèi)帶來的副作用。

5 展望

目前，酶固定化技術(shù)已在許多行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。今后，固定化酶研究的主要趨勢(shì)，在于改進(jìn)傳統(tǒng)的固定化法、開發(fā)新型的固定化技術(shù)和天然高分子改性載體的研究。而利用納米技術(shù)、超臨界技術(shù)和膜技術(shù)等技術(shù)手段來進(jìn)行酶的固定化，也必定會(huì)成為今后研究的熱點(diǎn)。同時(shí)，未來研究的重點(diǎn)還將側(cè)重于開發(fā)新型和高效的固定化酶反應(yīng)器，從而來進(jìn)一步提高生產(chǎn)力和轉(zhuǎn)化率。隨著固定化酶技術(shù)在各行各業(yè)的廣泛應(yīng)用，酶固定化技術(shù)也必將會(huì)得到進(jìn)一步的發(fā)展。

[1]Yesim Y.Utilization of bentonite as a support material for im?mobilization of Candida rugosa lipase[J].Process Biochemistry,2005,40:2155-2159.

[2]Fernando L G,etal.Enzyme stabilization by glutaraldehyde crosslinkin g of adsorbed proteins on aminated supports[J].Journal of Biotechnology,2005,119:70-75.

[3]陳建龍.固定化酶研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程.2006,23(2).