不同溫度貯藏對中國櫻桃軟化進程中果膠及相關(guān)酶的影響

趙勝錦，張 放

（浙江大學果樹科學研究所，浙江杭州 310058）

中國櫻桃（Prunus psedoerasus Lindl.）屬于薔薇科落葉喬木果樹，是我國南方主栽的櫻桃種類。其果實味美形嬌，營養(yǎng)豐富，但采后易迅速軟化，不利于貯運。軟化是果實從成熟到衰老的必然生理過程，表現(xiàn)為果肉硬度下降、質(zhì)地變軟、果膠物質(zhì)降解、細胞壁酶活性變化[1-2]等。低溫貯藏是延長果實貯藏期的常用方法，降低溫度能顯著抑制果實呼吸、后熟、衰老和腐爛，有效控制果實成熟、保持果實品質(zhì)、延長果實壽命[3]，其中近生物冰點貯藏能最大程度延長水果的貯藏期[4-5]。目前國內(nèi)外有關(guān)低溫貯藏對采后果實生理影響已在香蕉[6]、桃[7-8]、荔枝[9]、甜櫻桃[10]、藍莓[11]等水果上有所報道。而中國櫻桃在這方面的研究報道較少，對其采后軟化生理變化過程知之甚少。本文以中國櫻桃為研究對象，探討不同溫度貯藏下果實呼吸生理和貯藏品質(zhì)的變化特點，以及對果膠組分和相關(guān)酶活性的影響。研究結(jié)果可進一步揭示不同溫度貯藏果膠組分及果膠酶的變化特點，探討中國櫻桃采后軟化機理，為其貯運保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國櫻桃 品種為‘烏皮櫻桃’，2013年5月采自浙江諸暨市（同山鎮(zhèn)中源村）櫻桃園，選擇樹齡5年、長勢基本一致的櫻桃樹，采收成熟度以果實鮮紅為基準，對樹冠中部的果實進行采收，采后立即運回浙江大學實驗室，進行預冷，選擇大小均勻、成熟度一致、無機械損傷、無病蟲害的果實，按每袋200g裝入櫻桃專用薄膜袋。

UV-2550紫外分光光度計 日本SHIMADZU（島津）公司；CheckpointⅡO2/CO2檢測儀 丹麥PBIDansensor（丹圣）公司；MiniScan EZ-MSEZ便攜式色差儀 美國HunterLab（亨特立）公司；TA-XT Plus物性分析儀 英國Stable Micro Systems公司；AtagoN-1a手持折光儀 日本ATAGO（愛拓）公司；5804R臺式冷凍離心機德國Eppendorf（艾本德）公司；XMT-102溫度數(shù)顯調(diào)節(jié)儀 余姚金電儀表有限公司；BS323S精密電子天平 德國賽多利斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將采后的中國櫻桃分別置于（0±0.5）、（4±0.5）、（20±0.5）℃冰柜中貯藏，相對濕度90%～95%。取樣時間為采后0、2、4、6、8、12、16d，測定果實生理指標；其余果實去核、液氮冷凍并置于-40℃貯藏待測。

1.2.2 果實生理指標的測定

1.2.2.1 呼吸速率的測定 將果實置于密閉容器1h，用O2/CO2檢測儀測定CO2含量，單位以mg/（kg·h）表示。

1.2.2.2 腐爛率的測定 果實表面有腐爛斑點者為腐爛果，計算公式：腐爛率（%）=（腐爛果/調(diào)查總果數(shù)）×100[12]。

1.2.2.4 果肉硬度的測定 用物性分析儀測定果實去皮硬度，圓形探頭直徑5mm，測試深度4mm，貫入速度1mm/s對縫合線兩側(cè)果面進行去皮測定。

1.2.2.5 可溶性固形物的測定 用手持折光儀測定可溶性固形物。

1.2.2.6 可滴定酸的測定 用0.1mol/L NaOH滴定至pH達到8.2，結(jié)果轉(zhuǎn)化為蘋果酸等價物[7]。

1.2.3 果膠的提取與測定 將中國櫻桃研磨成勻漿，用95%乙醇進行多次沸水浴，以Molish反應判斷樣品中已去除糖分，提取乙醇不溶物（AIS）[8，13]，真空干燥。取100mgAIS，用ddH2O和50mmol/L Na2CO3（含20mmol/L NaBH4）先后提取水溶性果膠（WSP）和原果膠（SSP）[14]。WSP和SSP含量的測定采用咔唑比色法在波長530nm測定OD值，以半乳糖醛酸制作標準曲線[15]。

1.2.4 細胞壁相關(guān)酶的提取與測定 多聚半乳糖醛酸酶（PG）的提取：取2.5g果肉，用1.0mol/L NaCl（pH6.0）4℃振蕩提取30min，上清液用飽和（NH4）2SO4溶液鹽析[16-17]，沉淀再溶于0.15mol/L NaCl（pH6.0）得提取液。酶活性測定以多聚半乳糖醛酸（PGA）為底物，用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定反應生成的D-半乳糖醛酸含量，測定條件：波長540nm，VDNS/V總體系=4/8，反應溫度100℃，反應時間5min，酶活性單位U=mg/（g·h）[18]。β-半乳糖苷酶（β-Gal）提?。喝?.5g果肉，用1.0mol/L NaCl（pH6.0）4℃振蕩提取30min，上清液即酶提取液。酶活測定以對硝基酚半乳糖苷（PNPG，美國Sigma公司）為底物，37℃反應15min，用10mmol/L Na2B4O7終止反應，在波長400nm測定反應生成的對硝基苯酚含量，酶活性單位U=nmol/（g·min）[19]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以上每組處理設置3次重復，實驗數(shù)據(jù)用Excel 2003進行統(tǒng)計分析，計算標準偏差（±SE）；并使用SAS軟件分別對硬度與WSP、SSP，WSP、SSP與PG、β-Gal進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度貯藏對中國櫻桃生理指標的影響

2.1.1 對腐爛率的影響 中國櫻桃在20℃貯藏下腐爛率上升最快，至第4d時達到100%，完全失去貯藏性，說明中國櫻桃不耐貯藏。因此，本實驗對中國櫻桃20℃貯藏4d后的相關(guān)生理指標不再進行測定（圖1）。20℃貯藏第1d中國櫻桃就開始腐爛，在4℃貯藏下則推遲4d才出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，而在0℃貯藏前8d均無腐爛發(fā)生，說明降低貯藏溫度能推遲腐爛的發(fā)生，且溫度越低越遲出現(xiàn)腐爛。中國櫻桃在4℃貯藏第8d后，腐爛率開始迅速上升，至第16d時達到64.62%，果實品質(zhì)顯著下降。而0℃貯藏第16d時腐爛率僅為9.45%，未失去貯藏性，說明0℃比4℃更有利于中國櫻桃貯藏，且其貯藏時間不低于16d。

圖1 不同溫度貯藏下中國櫻桃腐爛率的變化Fig.1 Changes in rotting rate of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.2 對呼吸速率的影響 呼吸速率與果實成熟衰老密切相關(guān)，采后呼吸作用越旺盛，各種生理生化進程就越快，貨架壽命就越短[20]。中國櫻桃采收時呼吸速率為12.95mg/（kg·h），20℃貯藏下呼吸速率急速上升，在第2d達到最大值19.85mg/（kg·h），比采收時上升53.31%，而在4℃和0℃貯藏下分別推遲2d和6d出現(xiàn)呼吸高峰，且呼吸速率值均遠遠低于20℃呼吸高峰，推測中國櫻桃呼吸類型屬于晚峰型（Late Peak Type）[3]，貯藏溫度不會影響呼吸高峰的出現(xiàn)，但溫度降低其呼吸速率越?。▓D2）。貯藏溫度越低，中國櫻桃的呼吸速率下降越顯著。4℃貯藏第2d時中國櫻桃呼吸速率為6.37mg/（kg·h），比采收時下降50.84%，0℃貯藏第4d時達到最小值2.49mg/（kg·h），比采收時下降80.77%，因此低溫抑制呼吸速率是抑制果實腐爛、延長貯藏時間的重要因素。

圖2 不同溫度貯藏下中國櫻桃呼吸速率的變化Fig.2 Changes in respiration rate of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.3 對果肉硬度的影響 硬度下降是果實軟化最主要的直觀表現(xiàn)。中國櫻桃采收硬度不高，為1.86N。20℃貯藏下，中國櫻桃果肉硬度下降最迅速，至第4d時降至1.36N，平均日下降11.83%，說明中國櫻桃采后果肉硬度下降迅速，不耐貯藏（圖3）。而在4℃貯藏下，中國櫻桃果肉硬度在前6d無明顯變化，但在貯藏后期有所下降，至第16d時降至1.40N，說明降低貯藏溫度能延緩中國櫻桃采后果肉硬度下降。在0℃整個貯藏過程中，果肉硬度均保持較高水平，且在貯藏前6d有所上升，貯藏后期無明顯下降，這與甜櫻桃在近生物冰點貯藏下果肉硬度變化的結(jié)果一致[5]。

圖3 不同溫度貯藏下中國櫻桃果肉硬度的變化Fig.3 Changes in fresh firmness of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.4 對果皮色差的影響 色差是評價果實成熟度和品質(zhì)的重要指標。采收時中國櫻桃果皮呈鮮紅色，總色差值（△E）為65.13，在20℃貯藏4d后明顯上升至68.93，這是因為果皮紅色不斷加深所導致（表1）。在4℃貯藏下，△E在第4d短暫下降后持續(xù)上升至70.02（6d），并保持在較高水平，說明4℃貯藏無法抑制果皮色澤向暗紅色轉(zhuǎn)變。在0℃貯藏下中國櫻桃在第4～8d內(nèi)明顯下降，但之后迅速上升至69.71，說明0℃能在貯藏前期延緩果皮色澤變暗。

2.1.5 對可溶性固形物和可滴定酸的影響 果實風味是評價商品價值的重要指標，主要用糖酸比來表示，可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）含量發(fā)生變化均會產(chǎn)生影響。采收時中國櫻桃糖酸比為8.07，20℃貯藏2d后上升并保持在10.85左右，其原因為TA持續(xù)下降、而TSS則先上升后下降（表2）。隨著貯藏溫度的下降，TSS上升和TA下降的趨勢均變緩，因此糖酸比在4℃和0℃貯藏分別在6d和8d后才快速上升。在4℃和0℃貯藏16d時，糖酸比均達到最大值13.55和14.55，主要是因為TA持續(xù)下降而TSS含量仍保持在較高水平。

2.2 不同溫度貯藏對中國櫻桃果膠變化的影響

研究認為，果膠酶及其引起的果膠組成的變化是細胞間粘合力下降的主要原因[21]。中國櫻桃果實中原果膠（SSP）在采收時的含量最高，達到15.82mg/100mgAIS，水溶性果膠（WSP）含量則最低，為4.22mg/100mgAIS（圖4）。伴隨著果實硬度下降，中國櫻桃的SSP不斷降解為WSP，WSP不斷升高。相關(guān)性分析表明，SSP與硬度變化呈正相關(guān)（r=0.74），而WSP與硬度變化呈負相關(guān)（r=-0.58），說明果實硬度下降與WSP和SSP含量的變化有關(guān)，推測果膠降解導致細胞結(jié)構(gòu)受損，從而導致果肉硬度迅速下降。20℃貯藏下SSP降解為WSP最為迅速。如圖4所示，20℃貯藏下SSP平均日下降7.48%，WSP前3d平均日上升21.13%，但在第4d時WSP明顯下降，這可能與果實腐爛，細胞結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞有關(guān)。4℃貯藏下，SSP貯藏前12d平均日下降2.50%，WSP平均日上升2.94%，說明降低溫度能顯著抑制WSP上升和SSP下降的速率。而在0℃貯藏過程中，SSP在貯藏前4d無明顯變化，貯藏6d后含量有明顯上升趨勢，之后開始迅速下降，但仍高于4℃同期；WSP在貯藏前4d呈明顯下降趨勢，在第4d達到最小值2.92mg/100mgAIS，比4℃條件下低31.69%，之后又迅速上升，在第12d時達到4℃相同水平。這些結(jié)果說明，低溫能有效地抑制SSP的下降和WSP含量的上升，而且在貯藏前期更為明顯。

表1 不同溫度貯藏下中國櫻桃色差的變化Table 1 Changes in Chromatic aberration of Chinese cherry fruit during different temperature storage

表2 不同溫度貯藏下中國櫻桃可溶性固形物和可滴定酸含量的變化Table 2 Changes in TSS and TA of Chinese cherry fruit during different temperature storage

圖4 不同溫度貯藏下中國櫻桃果膠的變化Fig.4 Changes in pectin of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.3 不同溫度貯藏對中國櫻桃果膠酶活性的影響

多聚半乳糖醛酸酶（PG）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）被認為與許多果實軟化密切相關(guān)，如桃[7，22-23]、青梅[14]、梨[24-25]等，但不同果實中PG和β-Gal活性變化不同，如PG在整個成熟期均不對酸櫻桃軟化起作用[26]，但卻是甜櫻桃軟化主導酶之一[27]。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，中國櫻桃果實PG和β-Gal與SSP（rPG=-0.64、rβ-Gal=-0.73）存在負相關(guān)，與WSP（rPG=0.87、rβ-Gal=0.83）正相關(guān)，說明PG和β-Gal與SSP降解為WSP密切相關(guān)，是導致果實硬度下降的重要原因。中國櫻桃20℃條件貯藏，PG和β-Gal活性均迅速上升，第3d時均達到最大值，為0.63mg/（g·h）和30.77nmol/（g·min），分別是采收時的1.16倍和2.17倍。貯藏第4d時PG和β-Gal活性均顯著下降，這可能與果實腐爛有關(guān)。在低溫貯藏下PG和β-Gal活性均受到不同程度抑制。0℃貯藏時PG活性顯著下降，與段學武等[6]報道的冷激處理抑制香蕉的PG酶活性的結(jié)果一致，第2d迅速降至0.47mg/（g·h），直至第8d后才開始明顯上升，而在4℃貯藏下PG活性在第6d后就開始上升，說明溫度越低越能抑制PG酶活性（圖5）。低溫對β-Gal酶活性抑制作用更為明顯，0℃對β-Gal活性抑制最為顯著，在貯藏第4d達到最小值8.56nmol/（g·min），遠低于4℃條件下貯藏，β-Gal活性。4℃貯藏較好抑制了貯藏前期的β-Gal活性，但第8d后β-Gal活性迅速上升至第12d達到最大值30.68nmol/（g·min），遠高于0℃貯藏下β-Gal活性水平（圖6）。以上結(jié)果說明，PG和β-Gal是參與中國櫻桃果實軟化的重要酶，其酶活性的升高很有可能是引起原果膠降解的重要原因，貯藏溫度越低越能抑制其活性，從而延緩果膠物質(zhì)降解，延長貯藏時間。與PG相比，β-Gal與果膠組分變化關(guān)系更為密切，對低溫抑制也更敏感，與中國櫻桃軟化密切相關(guān)。

圖5 不同溫度貯藏下中國櫻桃多聚半乳糖醛酸酶的變化Fig.5 Changes in PG of Chinese cherry fruit during different temperature storage

圖6 不同溫度貯藏下中國櫻桃β-半乳糖苷酶的變化Fig.6 Changes in β-Gal of Chinese cherry fruit during different temperature storage

3 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，低溫貯藏可顯著抑制中國櫻桃采后呼吸速率，降低腐爛率，延長貯藏時間，該結(jié)果與甜櫻桃[5]、桃[28]表現(xiàn)一致。降低貯藏溫度能明顯抑制中國櫻桃軟化進程，主要原因是低溫延緩了PG和β-Gal酶活性上升，進而抑制了果膠的降解，對保持中國櫻桃硬度起到重要作用。0℃貯藏對抑制中國櫻桃果實采后呼吸速率和腐爛率的效果明顯優(yōu)于4℃，但對果皮色差和糖酸比等貯藏品質(zhì)的影響區(qū)別不大。

綜上所述，低溫貯藏在整體上有利于抑制果實腐爛、延長貯藏時間、維持果實品質(zhì)。從貯藏效果和生產(chǎn)成本等綜合考慮，0℃貯藏更適宜于中國櫻桃貯藏，可以推廣應用于實際生產(chǎn)。

[1]Ali Z M，Chin L H，Lazan H.A comparative study on wall degrading enzymes，pectin modifications and softening during ripening of selected tropical fruits[J].Plant Sci，2004，167：317-327.

[2]張鵬龍，陳復生，楊宏順，等.果實成熟軟化過程中細胞壁降解研究進展[J].食品科技，2010，35（11）：62-66.

[3]李富軍，張新華.果蔬采后生理與衰老控制[M].北京：中國環(huán)境科學出版社，2004（11）：161-162.

[4]Inaba M，Philip G C.Cold shock treatment of mature green tomatoes delay color development and increase shel-life during room temperature storage[J].Proceedings of the Florida State Horticultural Society，1986，99：143-145.

[5]任杰，張素麗，冷平，等.不同處理對甜櫻桃近生物冰點貯藏效果研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報，2009，14（2）：75-80.

[6]段學武，龐學群，張昭其，等.冷激處理對香蕉后熟軟化及相關(guān)酶活性的影響[J].園藝學報，2002，29（3）：214-217.

[7]張鑫，熊彩珍，顧立明，等.不同中晚熟水蜜桃品種的品質(zhì)性狀評價[J].浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2011，37（5）：551-556.

[8]周培根，羅祖友，戚曉玉，等.桃成熟期間果實軟化與果膠與有關(guān)酶的關(guān)系[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，1991，14（2）：33-37.

[9]黃海雄，黃育強.不同貯藏溫度對冷處理護色荔枝貯藏品質(zhì)的影響[J].保鮮與加工，2013，13（1）：15-20.

[10]Wei J M，Qi X D，Guan J F，et al.Effect of cold storage and 1-MCP treatment on postharvest changes of fruit quality and cell wall metabolism in sweet cherry[J].Journal of Food Agriculture&Environment，2011，34（9）：118-122.

[11]Connor A M，Luby J J，Hancock J F，et al.Changes in fruit antioxidant activity among blueberry cultivars during coldtemperature storage[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（4）：893-898.

[12]劉尊英，曾名勇，董士遠.1-MCP對中國櫻桃貯藏效應的初步研究[J].落葉果樹，2005，37（1）：4-6.

[13]Fils-Lycaon B，Buret M.Loss of firmness and changes in pectic fractions during ripening and overripening of sweet cherry[J].Hort Science，1990，25（7）：777-778.

[14]陸勝民，席玙芳，張耀洲，等.梅果采后軟化與細胞壁組分及其降解酶活性的變化[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2003，36（5）：595-598.

[15]曹建康，姜微波，趙玉梅，等.果蔬采后生理生化實驗指導[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2007：84-87.

[16]徐昌杰，陳昆松，張上隆.蔗糖酶對柑桔外切纖維素酶和外切多聚半乳糖醛酸酶活性測定的干擾及其排除[J].植物生理學通訊，1997，33（1）：43-46.

[17]闞娟，金昌海，汪志君，等.β-半乳糖苷酶及多聚半乳糖醛酸酶對桃果實成熟軟化的影響[J].揚州大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2006，27（3）：76-80.

[18]王天龍，仇宏偉，陳海華，等.3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定D-半乳糖醛酸含量的條件探索[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（16）：6829-6832.

[19]Andrews P K，Li S.Partial purification and characterization of β-D-Galactosidase from sweet cherry，a nonclimacteric fruit[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，1994，42：2177-2182.

[20]馮雙慶，周山濤，曹建康，等.果蔬貯運學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2008：50-51.

[21]Fischer R L，Bennett A B.Role of cell wall hydrolases in fruit ripening[J].Annual Review Plant Physiology Plant Molecule Biology，1991，42：675-703.

[22]Lauxmann M A，Borsani J，Osorio S，et al.Deciphering the metabolic pathways influencing heat and cold responses during postharvest physiology of peach fruit[J].Plant，Cell&Environment，2013，37（3）：601-606.

[23]梁慶沙，冷平，賀巖龍，等.冰溫貯藏后‘大久保’桃不同出庫方式對果實細胞壁組分及相關(guān)酶活性的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報，2010，15（1）：14-18.

[24]魏建梅，齊秀東，張海娥，等.京白梨果實采后PG、糖苷酶和LOX活性變化及其基因表達特性[J].園藝學報，2012，39（1）：31-39.

[25]樸一龍，趙蘭花，吳榮哲.梨果實在貯藏過程中果膠分解酶活性的變化[J].北方園藝，2009（4）：50-53.

[26]Kovacs E，Kristof Z，Perlaki R，et al.Cell wall metabolism during ripening and storage of nonclimacteric sour cherry（Prunus Cerasus L.CV.KáNTORJáNOSI）[J].Acta Alimentaria，2008，37（4）：415-426.

[27]Barrett D M，Gonzalez C.Activity of softening enzymes during cherry maturation[J].Food Sci，1994，59（3）：574-577.

[28]馬書尚，唐燕，武春林，等.1-甲基環(huán)丙烯和溫度對桃和油桃貯藏品質(zhì)的影響[J].園藝學報，2003，30（5）：525-529.