響應(yīng)面法優(yōu)化脈沖強光殺滅干豆腐大腸桿菌條件的研究

王鑫垚，馬 濤，王 勃，劉 賀，何余堂，惠麗娟

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州 121013）

大豆是我國重要的糧食作物，也是我國居民膳食中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源。以大豆為主要原料制作而成的中國傳統(tǒng)豆制品具有獨特的口感、風(fēng)味，營養(yǎng)豐富且易于消化吸收[1]。其中，干豆腐不僅可以即食也可以烹制菜肴，因此廣受人們的喜愛。干豆腐富含人體所必需而自身又不能合成的8種氨基酸[2]，還含具有降低膽固醇作用的不飽和脂肪酸亞油酸和對神經(jīng)系統(tǒng)有保健作用的維生素E和卵磷脂[3]。但是干豆腐的生產(chǎn)方式多為家庭手工作坊式生產(chǎn)，加工場所簡陋，衛(wèi)生狀況差，在儲存、運輸、銷售過程中容易二次污染[4]。此外，干豆腐的保質(zhì)期很短，這在一定程度上影響了產(chǎn)品的品質(zhì)和銷售，也限制了其生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[5]。

目前用于豆制品的保鮮技術(shù)主要有物理保鮮、化學(xué)保鮮和生物保鮮[6-8]。脈沖強光殺菌技術(shù)是近年來出現(xiàn)的利用瞬時、高強度的脈沖光能量進(jìn)行快速滅菌的一種物理殺菌新技術(shù)[9]，它利用惰性氣體燈發(fā)出與太陽光譜相近、波譜范圍由紫外線至紅外線區(qū)域的強烈脈沖閃光來殺滅固體表面、氣體和透明液體中的微生物[10-12]。使用脈沖強光技術(shù)對食品殺菌，對食品的營養(yǎng)成分、色澤、風(fēng)味和質(zhì)地影響較小[13]，這對風(fēng)味食品以及不適于高溫滅菌的食品尤為重要。

本研究應(yīng)用脈沖強光對干豆腐表面自然狀態(tài)存在的大腸桿菌進(jìn)行滅菌，然后利用響應(yīng)面法優(yōu)化滅菌條件。以大腸桿菌滅菌率為指標(biāo)，脈沖強光能量、照射距離和照射時間為影響因素，采用Box-Behnken實驗設(shè)計及響應(yīng)面得到脈沖強光對干豆腐大腸桿菌的最優(yōu)滅菌條件，以期為脈沖強光技術(shù)在豆制品滅菌中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干豆腐 于錦州當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I，水分：60.5g/100g、蛋白質(zhì)：18.8g/100g、脂肪：5.71g/100g；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

AR224CN電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；YXQ-LS-75S11立式全自動壓力滅菌鍋 北京科創(chuàng)百萬科技發(fā)展有限公司；DHG-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市鑫鑫實驗儀器廠；LA50-800H脈沖強光表面殺菌實驗柜 寧波中物光電殺菌技術(shù)有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；其中，實驗所用的脈沖強光殺菌柜內(nèi)安置有燈管可以產(chǎn)生脈沖強光，下方有一個石英板，可以上下調(diào)節(jié)距離，樣品放在上面即可進(jìn)行照射處理。

1.2 實驗方法

將當(dāng)天購買的干豆腐迅速放置在4℃條件下保藏，待實驗開始前，在無菌條件下切分成長20cm，寬10cm的長方形。

1.2.1 脈沖強光能量對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響 設(shè)計照射距離為10cm，照射時間為15s，脈沖強光能量取100、200、300、400、500J，對干豆腐進(jìn)行照射處理，未做處理的干豆腐作為空白對照。接著分別取樣并制備菌懸液，先進(jìn)行初發(fā)酵實驗，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL，于36℃培養(yǎng)48h，觀察小倒管內(nèi)是否有氣體產(chǎn)生。然后將產(chǎn)氣的樣品進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實驗，用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃培養(yǎng)48h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者為大腸菌群陽性管，記錄大腸菌群陽性管數(shù)。

1.2.2 照射距離對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響 設(shè)計脈沖強光能量為300J，照射時間為15s，照射距離取8、9、10、11、12cm，對干豆腐進(jìn)行照射處理，未做處理的干豆腐作為空白對照，分別取樣并制備菌懸液，再按照1.2.1方法依次進(jìn)行初發(fā)酵實驗和復(fù)發(fā)酵實驗，記錄產(chǎn)氣的大腸菌群陽性管數(shù)。

1.2.3 照射時間對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響 設(shè)計脈沖強光能量為300J，照射距離為10cm，照射時間取7、9、11、13、15、17、19s，對干豆腐進(jìn)行照射處理，未做處理的干豆腐作為空白對照，分別取樣并制備菌懸液，再按照1.2.1方法依次進(jìn)行初發(fā)酵實驗和復(fù)發(fā)酵實驗，記錄產(chǎn)氣的大腸菌群陽性管數(shù)。

1.2.4 大腸菌群檢驗 根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.3-2010食品微生物學(xué)檢驗：大腸菌群計數(shù)第一法：大腸菌群最可能數(shù)（MPN）計數(shù)法進(jìn)行大腸菌群計數(shù)[14]。

1.2.5 滅菌率的計算 殺菌效果用滅菌率表示，計算公式[15]為：

式中：N—滅菌前的大腸菌群最可能數(shù)；N0—滅菌后的大腸菌群最可能數(shù)。

1.2.6 實驗設(shè)計 根據(jù)Box-Benhnken實驗設(shè)計原理，選擇影響干豆腐大腸桿菌滅菌率（Y）的3個因素：脈沖強光能量（A）、照射距離（B）、照射時間（C）進(jìn)行組合，以－1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平，進(jìn)行三因素三水平的實驗設(shè)計，共17個實驗點，5個中心點重復(fù)實驗。

表1 實驗因素及水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 脈沖強光能量對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響 如圖1所示，較低的脈沖強光能量對干豆腐中大腸桿菌的殺滅效果相對較差。脈沖強光能量從100～300J，大腸桿菌滅菌率迅速提高，在實驗范圍內(nèi)能量超過300J后滅菌率保持穩(wěn)定?？紤]到節(jié)約能源，選擇脈沖強光能量300J為響應(yīng)面實驗的中心實驗點。

圖1 脈沖強光能量對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響Fig.1 Effect of pulsed light energy on E.coli sterilization rate of dry bean curd

2.1.2 照射距離對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響 如圖2所示，脈沖強光照射距離為10cm時，大腸桿菌的滅菌率最大，可以達(dá)到98.26%，繼續(xù)增大照射距離，發(fā)現(xiàn)距離過遠(yuǎn)對大腸桿菌的滅菌效果不好。因此，選擇照射距離10cm為響應(yīng)面實驗的中心實驗點。

圖2 照射距離對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響Fig.2 Effect of irradiation distance on E.coli sterilization rate of dry bean curd

2.1.3 照射時間對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響 如圖3所示，在選取的7個時間點上，脈沖強光照射時間在7～15s的范圍內(nèi)，大腸桿菌的滅菌率呈增加的趨勢，在15s時達(dá)到97.95%。15～19s，滅菌率變化不明顯。根據(jù)滅菌率，選擇照射時間15s為響應(yīng)面實驗的中心實驗點。

圖3 照射時間對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響Fig.3 Effect of irradiation time on E.coli sterilization rate of dry bean curd

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化脈沖強光滅菌條件

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。響應(yīng)面法以最經(jīng)濟的方式，較少的實驗次數(shù)和較短的時間對所選的實驗參數(shù)進(jìn)行全面研究。利用Design Expert 8.0.6軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得的響應(yīng)值大腸桿菌滅菌率（Y）對自變量脈沖強光能量（A）、照射距離（B）和照射時間（C）的二次多項式回歸模型方程：

Y=98.29+1.55A+1.08B+1.69C-1.43AB+0.63AC-2.09BC-6.03A2-4.86B2-10.46C2。

對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。從表3中可以看出模型是極顯著的（p＜0.0001），失擬項不顯著，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9941，說明該模型能夠解釋99.41%的響應(yīng)值變化，僅有總變異的0.59%不能用該模型解釋。模型擬合程度良好，實驗誤差小，因此可用此模型分析和預(yù)測經(jīng)脈沖強光照射處理后干豆腐大腸桿菌的滅菌條件。

由表3回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，模型一次項A、B、C、二次項A2、B2、C2極顯著；交互相AB顯著、BC極顯著；交互項AC不顯著。由p值顯著性的大小可以看出，各實驗因素對大腸桿菌滅菌率的影響大小順序為：照射時間（C）＞脈沖強光能量（A）＞照射距離（B）。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Significance test for regression coefficients

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 回歸模型方程的響應(yīng)面分別見圖4～圖6。對響應(yīng)面及等高線圖進(jìn)行分析，可以直觀地看出優(yōu)化區(qū)域和不同因素之間相互作用的程度[16]。此外，橢圓形等高線圖表示兩兩之間的交互作用比較顯著。

圖4表示的是將照射時間控制在0水平，脈沖強光能量、照射距離對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響。脈沖強光能量和照射距離的交互作用對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響顯著。圖5顯示出脈沖強光能量和照射時間對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響不顯著。從圖6可以看出照射距離和照射時間的交互作用對干豆腐大腸桿菌滅菌率的影響顯著。在一定范圍內(nèi)，大腸桿菌的滅菌率隨著照射時間的延長而顯著增加。

圖4 脈沖強光能量、照射距離對干豆腐大腸桿菌滅菌率影響響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface of pulsed light energy，irradiation distance on sterilization rate of E.coli from dry bean curd

圖5 脈沖強光能量、照射時間對干豆腐大腸桿菌滅菌率影響響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface a of pulsed light energy，irradiation time on sterilization rate of E.coli from dry bean curd

圖6 照射距離、照射時間對干豆腐大腸桿菌滅菌率影響響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of irradiation distance，irradiation time on sterilization rate of E.coli from dry bean curd

Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化獲得干豆腐大腸桿菌的脈沖強光滅菌最優(yōu)條件，在脈沖強光能量312J、照射距離10cm、照射時間15.2s時，大腸桿菌滅菌率為98.49%?？紤]到現(xiàn)有脈沖強光設(shè)備的型號及實際操作的方便，將工藝參數(shù)調(diào)整為脈沖強光能量300J、照射距離10cm、照射時間15s。實際操作環(huán)境要保持無菌和低溫，以防二次污染和微生物快速的生長繁殖。

2.2.3 回歸模型的驗證 通過響應(yīng)面法優(yōu)化脈沖強光殺滅干豆腐大腸桿菌的滅菌條件，在優(yōu)化條件下進(jìn)行實驗，通過比較預(yù)測值和實驗值驗證模型的有效性[17]。采用調(diào)整后的參數(shù)進(jìn)行實驗，結(jié)果得到的滅菌率為98.29%。實驗值與預(yù)測值98.49%相差很小，表明該模型可以較好地反映出脈沖強光對干豆腐大腸桿菌的殺菌效果，從而也證明了Box－Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化干豆腐大腸桿菌的脈沖強光殺菌工藝的可行性。

3 結(jié)論

本研究采用實驗設(shè)計軟件Design Expert 8.0.6，根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計建立脈沖強光技術(shù)對干豆腐表面自然狀態(tài)的大腸桿菌進(jìn)行滅菌的二次多項數(shù)學(xué)模型，并優(yōu)化出滅菌參數(shù)。實驗得出影響大腸桿菌滅菌率的大小順序為：照射時間＞脈沖強光能量＞照射距離；脈沖強光能量300J、照射距離10cm、照射時間15s。在該條件下大腸桿菌滅菌率可以達(dá)到98.29%。

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