氣相色譜方法同時(shí)測(cè)定果蔬及糧谷中6種除草劑殘留

李麗娟，吳 青，翁柔丹，王秀珍，吳詩(shī)韻

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

近年來(lái)，我國(guó)對(duì)除草劑的需求量和使用量逐年上漲，氟樂(lè)靈（trifluralin）、2，4-D丁酯（2，4-D butylate）、乙草胺（acetochlor）、甲草胺（alachlor）、異丙甲草胺（metolachlor）、丁草胺（butachlor）是其中需求量較大的幾個(gè)品種[1]。除草劑的廣泛使用會(huì)導(dǎo)致其在農(nóng)作物產(chǎn)品上的殘留，從而通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而危害人類(lèi)健康。氟樂(lè)靈是一種二硝基苯胺類(lèi)除草劑，有研究[2]證明它可能會(huì)對(duì)大鼠肝、腎微粒體酶產(chǎn)生影響。2，4-D丁酯是一種苯氧羧酸類(lèi)除草劑，在我國(guó)生產(chǎn)量、使用量和出口量非常大，有研究[3]顯示2，4-D丁酯會(huì)影響6～10歲兒童的行為和智力。酰胺類(lèi)除草劑在全球除草劑市場(chǎng)中位列第三，銷(xiāo)量最大的品種主要包括甲草胺、乙草胺、異丙甲草胺和丁草胺[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[5-7]證明，甲草胺、乙草胺、異丙甲草胺和丁草胺本身或通過(guò)一系列酶反應(yīng)后具有致癌或致突變性。傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)（索氏提取、振蕩提取、液-液萃取法）費(fèi)時(shí)，消耗大量溶劑且不適合大批量樣品的處理[8-9]，已無(wú)法滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留快速準(zhǔn)確檢測(cè)的需要。QuEChERS方法是2003年美國(guó)農(nóng)業(yè)部開(kāi)發(fā)的一種新的農(nóng)殘分析前處理方法，主要應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留分析檢測(cè)領(lǐng)域，具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)約溶劑、分析時(shí)間短、成本低、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)[10]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)這6種除草劑的檢測(cè)以單殘留分析[11-12]或同一類(lèi)的多殘留分析[13-16]較多，也有對(duì)某幾種不同類(lèi)除草劑同時(shí)檢測(cè)的報(bào)道[17-18]，其中QuEChERS方法已應(yīng)用到同一類(lèi)除草劑的多殘留檢測(cè)中[15-16]，但目前未見(jiàn)同時(shí)檢測(cè)這6種除草劑的QuEChERS-GC方法報(bào)道。本文研究建立了可同時(shí)檢測(cè)果蔬和糧谷等基質(zhì)復(fù)雜樣品中這6種除草劑的QuEChERS-GC方法。此方法快速、簡(jiǎn)便、節(jié)約溶劑，適合于樣品的批量處理，并能滿(mǎn)足分析要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氟樂(lè)靈（99.0%）、2，4-D丁酯（99.0%）、乙草胺（97.0%）、甲草胺（99.0%）、異丙甲草胺（98.0%）、丁草胺（98.0%）標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；正己烷（色譜純）

Honeywell公司；石墨化炭黑（GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（ODS C18） Agela Technologise公司；其他試劑 均為分析純。

Clarus 600氣相色譜儀帶電子捕獲檢測(cè)器（ECD）、82位自動(dòng)進(jìn)樣器 美國(guó)Perkin Elmer公司；DB-1701色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm） 美國(guó)Agilent公司；KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司；WX-80A旋渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；攪拌機(jī) 飛利浦家庭電器有限公司；高速組織勻漿機(jī) 上海標(biāo)本模型廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 蔬菜水果類(lèi)：將樣品攪碎，用高速勻漿機(jī)（15000r/min）勻漿至糊狀，稱(chēng)取10.0g樣品（精確到0.01g）于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入20mL乙腈，加入3g氯化鈉和5g無(wú)水硫酸鎂，振蕩1min，超聲（135W，42kHz）10min，4000r/min離心5min。取上清液5mL置于另一50mL離心管中，加入175mg PSA、25mg C18、60mg GCB和500mg無(wú)水硫酸鎂，渦旋振蕩4min，4000r/min離心10min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用正乙烷復(fù)溶，定容至1mL，溶液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，備用。

糧谷類(lèi)：將樣品粉碎，過(guò)40目篩，稱(chēng)取5.0g樣品（精確到0.01g）于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入5mL水輕輕搖晃使樣品分散，加入20mL乙腈，加入3g氯化鈉和5g無(wú)水硫酸鎂，振蕩1min，超聲（135W，42kHz）10min，4000r/min離心5min。取上清液10mL置于另一50mL離心管中，加入250mgPSA、200mg C18和500mg無(wú)水硫酸鎂，渦旋振蕩3min，4000r/min離心10min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用正乙烷復(fù)溶，定容至1mL，溶液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：DB-1701（30m×0.25mm，0.25μm）；載氣：氮?dú)?，恒流模式，流速?.0mL/min；尾吹氣：氮?dú)猓?0mL/min；進(jìn)樣口溫度：230℃；檢測(cè)器溫度：300℃；進(jìn)樣量：1.0μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。升溫程序：150℃保持1min，以20℃/min升溫到245℃保持10min，再以5℃/min升溫到260℃保持5min。

1.2.3 凈化條件的優(yōu)化 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選取對(duì)除草劑回收率影響大的因素做正交實(shí)驗(yàn)。果蔬樣品采用PSA含量、C18含量、GCB含量以及凈化時(shí)間進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，糧谷樣品采用PSA含量、C18含量、凈化時(shí)間進(jìn)行三因素三水平L9（33）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以除草劑的回收率為指標(biāo)，篩選出最佳的凈化條件，正交實(shí)驗(yàn)因素水平如表1、表2所示。

表1 果蔬正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test of vegetables and fruits

表2 糧谷正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test of cereals

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

分別采用0.1%冰乙酸-正乙烷飽和的乙腈溶液、乙酸乙酯、丙酮和乙腈對(duì)樣品中的除草劑進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用0.1%冰乙酸-正乙烷飽和的乙腈溶液、乙酸乙酯、丙酮提取時(shí)，蔬菜提取液顏色較深，且出現(xiàn)黃綠色粘稠狀液層；而糧谷類(lèi)樣品提取液較渾濁，濃縮之后也有黃色的粘稠狀物質(zhì)析出，這樣的提取液容易污染儀器系統(tǒng)，影響色譜柱的使用壽命，且在色譜圖中出現(xiàn)基質(zhì)干擾嚴(yán)重的現(xiàn)象，回收率偏高（在120%以上），影響目標(biāo)物的檢測(cè)和定量。而用乙腈作提取溶劑時(shí)，無(wú)論是果蔬樣品還是糧谷類(lèi)樣品，提取出的脂溶性色素、油脂等雜質(zhì)較少，提取液經(jīng)吸附劑凈化后顏色較淺，凈化效果好，回收率高。在80%～110%之間。因此選用乙腈作為提取劑。

2.2 凈化條件的選擇

2.2.1 吸附劑的選擇 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）同時(shí)含有伯胺、仲胺兩個(gè)氨基，是一種弱陰離子交換吸附劑，對(duì)果蔬中的色素、有機(jī)酸、糖及其他基質(zhì)共萃取物均有良好凈化能力，配合使用石墨化炭黑粉吸附色素，其凈化效果更佳[19]；石墨化炭黑（GCB）能有效去除色素如葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素，特別對(duì)含色素豐富的果蔬樣品有較好凈化能力[20]；十八烷基硅烷（C18）具有疏水作用，對(duì)非極性組分有吸附作用，去除蛋白質(zhì)和脂肪的效果較好[21]。對(duì)于果蔬樣品，研究發(fā)現(xiàn)僅采用PSA，色素去除效果不理想，干擾峰多，影響定量，見(jiàn)圖1A；而復(fù)配使用PSA、C18和GCB凈化提取液，可使凈化液呈淺色或無(wú)色，干擾峰少，基質(zhì)干擾小，凈化效果好，見(jiàn)圖1B。對(duì)糧谷樣品，僅復(fù)配使用PSA和C18就能夠有效去除樣品中的色素、脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。依此結(jié)果設(shè)計(jì)果蔬及糧食的正交實(shí)驗(yàn)因素。

圖1 PSA處理樣品（A）和PSA、C18、GCB混合處理樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of samples after dealt with PSA（A）and with mixture of PSA，C18，GCB（B）

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到最佳的單因素水平，在最佳單因素水平附近選取另外兩個(gè)水平，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)L9（34），對(duì)果蔬中6種除草劑的凈化劑用量和凈化時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以6種除草劑的平均回收率為參考指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由R值大小可知，影響6種除草劑回收率的因素順序?yàn)镃（GCB）＞A（PSA）＞B（C18）＞D（凈化時(shí)間）。選擇各因素最大K值對(duì)應(yīng)的水平，確定出果蔬最佳凈化條件為A3B1C1D3，即PSA為175mg，C18為25mg，GCB為60mg，凈化時(shí)間（渦旋振蕩）4min，按這個(gè)條件進(jìn)行了樣品前處理分析和平行實(shí)驗(yàn)，得出平均回收率是93.25%。這個(gè)結(jié)果雖然略低于正交實(shí)驗(yàn)中的第8組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但它的回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差仍在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，且B1對(duì)應(yīng)的C18的用量（25mg）低于第8組中B2對(duì)應(yīng)的C18的用量（50mg），降低了前處理成本。

糧谷類(lèi)由于色素含量不高，僅復(fù)配PSA和C18就能夠去除樣品中的油脂、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，因此選擇PSA用量、C18用量和凈化時(shí)間三個(gè)單因素設(shè)計(jì)三因素三水平L9（33）的正交實(shí)驗(yàn)，以6種除草劑的平均回收率為參考指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 果蔬正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 3 Analysis of orthogonal test of vegetables and fruits

表4 糧谷正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Analysis of orthogonal test of cereals

由R值大小可知，影響6種除草劑回收率的因素順序?yàn)锳（PSA）＞B（C18）＞C（凈化時(shí)間）。選擇各因素最大K值對(duì)應(yīng)的水平，確定出糧谷類(lèi)最佳凈化條件為A3B2C1，即PSA為250mg，C18為200mg，凈化時(shí)間（渦旋振蕩）3min，此時(shí)的回收率為99.78%。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍和檢出限（LOD） 采用摸索出的最佳色譜條件分析6種除草劑，獲得的色譜圖見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，6種除草劑得到良好的分離，且在18min內(nèi)完成檢測(cè)。

圖2 6種除草劑色譜圖Fig.2 Chromatogram of six herbicides

取空白樣品提取液作為6種除草劑標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液：氟樂(lè)靈的濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1μg/mL，2，4-D丁酯、乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺和丁草胺的濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0μg/mL，以各濃度峰面積Y對(duì)相應(yīng)濃度X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。氟樂(lè)靈在0.005～0.1μg/mL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，其余5種除草劑在0.05～1.0μg/mL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2均大于0.999。

以信噪比S/N=3計(jì)算6種除草劑的檢出限（LOD），從表5可知，6種除草劑的檢出限在0.002～0.03μg/mL之間。

表5 6種除草劑的線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 5 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients and limit of detection of six herbicides

2.3.2 加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及最低定量限（LOQ） 在10.0g空白青菜中添加適量6種除草劑標(biāo)準(zhǔn)混合液，每個(gè)添加量平行三份，采用摸索出的最佳凈化條件處理樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，得到的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和LOQ見(jiàn)圖3和表6。

結(jié)果表明，三份平行樣品中，6種除草劑的平均回收率均大于80%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.02%～8.28%之間；以信噪比S/N=10計(jì)算6種除草劑的定量限LOQ，氟樂(lè)靈的LOQ為0.002mg/kg，2，4-D丁酯、乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺和丁草胺的LOQ為0.02mg/kg。

2.4 實(shí)際樣品分析

采用本文建立的方法對(duì)市售的水果蔬菜、糧谷中的除草劑進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表7。從表7可見(jiàn)，在6種除草劑中，除未檢測(cè)出丁草胺外，其余5種除草劑在不同的食品中均有檢出，有些食品還同時(shí)檢測(cè)出2種除草劑。

圖3 6種除草劑加標(biāo)色譜圖Fig.3 Chromatogram of six herbicides with the spiked sample

表6 6種除草劑的平均加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及LOQTable 6 Recovery，relative standard deviation and the limit of quantification of six herbicides

GB2763-2012《食品中農(nóng)藥殘留最大限量》中規(guī)定玉米中氟樂(lè)靈、2，4-D丁酯、乙草胺的最大殘留限量為0.05mg/kg，甲草胺為0.2mg/kg，異丙甲草胺為0.1mg/kg，丁草胺為0.5mg/kg；花生仁中氟樂(lè)靈、甲草胺的最大殘留限量為0.05mg/kg，乙草胺為0.1mg/kg，異丙甲草胺為0.5mg/kg；大豆中氟樂(lè)靈的最大殘留限量為0.05mg/kg，乙草胺為0.1mg/kg，甲草胺為0.2mg/kg，異丙甲草胺為0.5mg/kg；糙米中乙草胺、甲草胺的最大殘留限量為0.05mg/kg，異丙甲草胺為0.1mg/kg；大米中丁草胺的最大殘留限量為0.5mg/kg。檢測(cè)結(jié)果顯示在所檢的糧谷類(lèi)樣品中，未見(jiàn)6種除草劑殘留量超標(biāo)情況。目前國(guó)標(biāo)還沒(méi)有規(guī)定上述6種除草劑在蔬菜水果中的最大殘留限量，但實(shí)際檢測(cè)結(jié)果顯示，在10種蔬菜中，有5種蔬菜有除草劑殘留。

表7 樣品分析結(jié)果Table 7 Analytical results of samples

3 結(jié)論

建立了測(cè)定蔬菜水果和糧谷類(lèi)食品中6種除草劑（氟樂(lè)靈、2，4-D丁酯、乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺）的QuEChERS-GC方法，樣品前處理快速、簡(jiǎn)便，節(jié)約溶劑。所建立的方法在18min內(nèi)即可完成6種除草劑的同時(shí)檢測(cè)，具有快速、簡(jiǎn)便、可批量處理、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)，可作為監(jiān)控果蔬和糧谷中除草劑殘留檢測(cè)的一種快速、簡(jiǎn)便的方法。

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