以Triton X－100處理重組E.coli制備重組人SOD 包涵體

劉建榮，顧雅君

（1.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071002；3.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

破碎重組大腸桿菌（E.coli）提取包涵體蛋白，實(shí)驗(yàn)室中普遍使用超聲破菌法［1－4］，但處理量較小.工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)多采用機(jī)械法［5－6］，如高壓勻漿法［7］和珠磨法［8］，但需配套使用相應(yīng)的儀器設(shè)備，并且價(jià)格昂貴.化學(xué)滲透破菌法常用于胞內(nèi)可溶性蛋白的釋放［7］.非離子表面活性劑Triton X－100對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，作用于細(xì)胞時(shí)可以改變細(xì)胞的通透性，使內(nèi)含物得以釋放.為降低成本，簡化操作，本實(shí)驗(yàn)對(duì)采用Triton X－100處理重組E.coli釋放并制備重組人超氧化物歧化酶rhSOD（recombinant human SOD）包涵體進(jìn)行初探，并對(duì)提取的包涵體進(jìn)行了體外復(fù)性.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種為含重組質(zhì)粒pTK－rhSOD的大腸桿菌DH5α（本研究室構(gòu)建）.氧化型（GSSG）和還原型谷胱甘肽（GSH）（TaKaRa公司），β－巰基乙醇（β－ME）（Serva公司），三羥甲基氨基甲烷（Tris）（Amresco公司，進(jìn)口分裝），Triton X－100（上海生物工程公司），鄰苯三酚和尿素等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?Model 250／2.5型電泳儀（Bio－Rad公司），WFJ 2100型可見分光光度計(jì)（尤尼克上海儀器有限公司），WD－9413B 凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一儀器廠）.

1.2 方法

1.2.1 種子液、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行.

1.2.2 TritonX－100處理重組E.coli及包涵體的純化（Triton法）

取100mL 發(fā) 酵 液 菌 體 按 體 積 比10:1懸 浮 于10 mL 破 菌 緩 沖 液 中（0.05 mol／L Tris·HCl，0.15mol／L NaCl，體 積 分 數(shù)0.5% 的Triton X－100，pH 7.5），以 旋 渦 振 蕩 器 混 勻，室 溫 靜 置 過 夜，8 000r／min離心10min，沉淀為包涵體粗提物.用洗滌緩沖液（含0.5mol／L 尿素的破菌緩沖液）將粗提物洗滌2次后，離心后的沉淀再以0.05mol／L Tris－HCl（含0.15mol／L NaCl，pH7.5）緩沖液洗滌1次，得TritonX－100處理的純化包涵體.

1.2.3 超聲波破碎重組E.coli和包涵體的純化（超聲法）

另取100mL發(fā)酵液菌體按體積比10:1懸浮于10mL 的0.05mol／L Tris－HCl（含0.15mol／L NaCl，pH7.5）緩沖液中，冰水浴下超聲（功率80W）處理10min，離心得超聲破菌包涵體粗提物.洗滌過程同上，得超聲波處理的純化包涵體，用作對(duì)照.

1.2.4 包涵體的變性溶解

分別以4mL溶解緩沖液（0.05mol／L Tris·HCl，8mol／L 尿素，0.1mol／Lβ－巰基乙醇，0.15mol／L NaCl，pH 7.5）溶解上述2種方法制備的包涵體，室溫靜置過夜，8 000r／min離心30min去沉淀，上清液即為包涵體溶解液，留待復(fù)性.

1.2.5 包涵體的復(fù)性

采用透析法復(fù)性rhSOD 包涵體.將上述2種方法制備的包涵體溶解液平行進(jìn)行如下操作：

1）透析：將包涵體溶解液裝入透析袋，先對(duì)100mL 透析緩沖液Ⅰ（0.05mol／L Tris·HCl，1mol／L 尿素，2mmol／L GSH，0.5mmol／L GSSG，pH 7.5）于4 ℃透析24h后（期間數(shù)次搖動(dòng)透析液），透析樣品于8 000r／min離心30 min，沉淀留樣行SDS－PAGE；將上清液裝入透析袋繼續(xù)對(duì)100 mL 透析緩沖液Ⅱ（0.05mol／L Tris·HCl，0.1mol／L尿素，pH 7.5）于4 ℃透析24h（期間數(shù)次搖動(dòng)透析液），透析樣品同上離心后，沉淀留樣電泳，上清液測(cè)定蛋白含量.

2）復(fù)性：將透析后的離心上清液以透析緩沖液Ⅱ稀釋為0.5mg／mL，補(bǔ)加終濃度為50μmol／L 的Cu2＋和5μmol／L的Zn2＋，于4 ℃靜置復(fù)性，分別于2，4，6，8，24，48h取樣測(cè)定活性和蛋白濃度.樣品在復(fù)性一段時(shí)間后若有沉淀物析出，取樣于8 000r／min離心10min，測(cè)上清液蛋白含量及活性，計(jì)算單位活力及比活，沉淀留樣電泳.

1.2.6 分析方法

考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，終止劑改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法（終止劑法）［10］測(cè)定rhSOD 活性，純化的包涵體、透析和復(fù)性期間產(chǎn)生的沉淀物和復(fù)性樣品純度分析采用120g／L SDS－PAGE，WD－9413B凝膠成像分析系統(tǒng)掃描凝膠，以蛋白含量分析軟件gel－pro 32測(cè)定目的蛋白純度.

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)產(chǎn)物和純化包涵體的電泳分析

對(duì)菌體表達(dá)產(chǎn)物和純化包涵體的SDS－PAGE分析結(jié)果見圖1.rhSOD 包涵體的表達(dá)量約占菌體總蛋白的30%左右，以Triton X－100處理（以下簡稱Triton法）得到的包涵體純度（泳道3）低于超聲破菌法（以下簡稱超聲法，泳道2），但經(jīng)8mol／L尿素溶解且離心后，Triton法的（泳道5）卻與超聲法（泳道4）相近，均為65%左右.這是由于Triton法制備的包涵體經(jīng)8mol／L尿素變性溶解后的離心沉淀物中含有大量不被尿素所溶解的雜蛋白的去除所致（泳道7）.

圖1 純化rhSOD包涵體的SDS－PAGE圖譜Fig.1 SDS－PAGE analysis of purified rhSOD inclusion body

2.2 包涵體的復(fù)性

包涵體復(fù)性結(jié)果如表1所示.隨著復(fù)性時(shí)間的延長，單位活力逐漸增加，6h后基本穩(wěn)定，超過24h后略有下降.復(fù)性過程中隨著蛋白的析出，復(fù)性液蛋白含量隨復(fù)性時(shí)間延長而降低，但比活卻呈現(xiàn)增加趨勢(shì).復(fù)性48h時(shí)，Triton法和超聲法所得樣品比活接近，均達(dá)2 800U／mg蛋白以上.

表1 rhSOD包涵體的復(fù)性結(jié)果Tab.1 Result of renaturation of rhSOD inclusion body

2.3 對(duì)透析和復(fù)性過程中析出沉淀物的檢測(cè)及復(fù)性rhSOD 純度檢測(cè)

包涵體溶解液在透析和隨后的復(fù)性過程中，一些蛋白會(huì)呈絮狀聚集析出，對(duì)這些沉淀和復(fù)性rhSOD 的電泳結(jié)果如圖2所示.2次透析產(chǎn)生的沉淀中雖含有rhSOD，但與析出的雜蛋白比例相比，rhSOD 只占較少部分，多數(shù)為雜蛋白.在復(fù)性過程中仍有雜蛋白繼續(xù)析出，且布滿整個(gè)泳道，但目的蛋白rhSOD 卻沒有析出.分別使用Triton 法和超聲法制備的rhSOD 包涵體，不論在透析還是復(fù)性過程中，雜蛋白析出量始終前者大于后者.因此，Triton 法最終所得到的目的蛋白純度與超聲法相近，2種方法均達(dá)90% 以上.

圖2 包涵體溶解液透析和復(fù)性過程中析出的沉淀物和復(fù)性rhSOD的SDS－PAGE圖譜Fig.2 SDS－PAGE analysis of renaturaed rhSOD and precipitate separated from dialysis and renaturation

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以Triton X－100處理重組E.coli提取制備rhSOD 包涵體，最終包涵體溶解液純度與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的超聲破菌法相近，其中關(guān)鍵一步是，包涵體以含8mol／L尿素的溶解緩沖液變性溶解后，充分放置，離心去除的雜質(zhì)中含有大量未溶解的雜蛋白（圖1，泳道7），對(duì)包涵體溶解液純度的提高起到重要作用.實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，溶解后的包涵體溶解液在對(duì)1mol／L尤其0.1mol／L尿素透析時(shí)，以及在補(bǔ)加Cu2＋和Zn2＋復(fù)性過程中，均有蛋白沉淀析出.經(jīng)電泳檢測(cè)，除少量目的蛋白析出外，雜蛋白占有的比例遠(yuǎn)大于目的蛋白.因此，在單位活力不變的情況下使比活再次得到提高.

復(fù)性后的rhSOD 純度達(dá)90%以上，比活為2 801U／mg蛋白，原因可能是一部分包涵體在復(fù)性過程中，Cu2＋沒有結(jié)合于酶活性中心而不能表現(xiàn)出活性，但卻以可溶性的折疊中間體狀態(tài)與復(fù)性的rhSOD 共存.對(duì)復(fù)性rhSOD 以金屬螯合親和層析可使其進(jìn)一步純化和復(fù)性［11］.

采用Triton法處理重組E.coli提取的rhSOD 包涵體，經(jīng)體外復(fù)性后比活與超聲法相近.與機(jī)械破菌法相比，以Triton X－100處理重組E.coli提取制備包涵體的方法無需使用昂貴特殊儀器設(shè)備破碎菌體，簡單實(shí)用，成本低廉，非常易于放大規(guī)模生產(chǎn).

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