糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中鈣離子濃度的變化△

邵珺 孫尉 姚勇 王如心 曹葭

【實(shí)驗(yàn)研究】

糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中鈣離子濃度的變化△

邵珺 孫尉 姚勇 王如心 曹葭

大電導(dǎo)鈣離子激活鉀離子通道；視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

目的 探討糖尿病視網(wǎng)膜病變SD大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中鈣離子濃度的變化。方法 取40只正常雄性SD大鼠，采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)100 mg·kg-1腹腔內(nèi)注射建立糖尿病大鼠模型，持續(xù)6個(gè)月后經(jīng)眼底熒光血管造影證實(shí)各大鼠出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變，作為糖尿病視網(wǎng)膜病變組。同時(shí)選擇正常SD大鼠40只及單純形成糖尿病的大鼠40只分別用作正常對(duì)照組及單純糖尿病組。酶消化法分離出視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，熒光測(cè)定儀測(cè)定三組大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 造模8周后，測(cè)得正常對(duì)照組和單純糖尿病組大鼠血糖水平分別為(6.77±0.18)mmol·L-1和(31.14±0.75)mmol·L-1，符合成模條件，6個(gè)月后糖尿病視網(wǎng)膜病變組大鼠眼底熒光血管造影確定為糖尿病視網(wǎng)膜病變SD大鼠模型。糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(255±10)nmol·L-1較正常對(duì)照組(123±11)nmol·L-1和單純糖尿病組(152±23)nmol·L-1明顯增高，三組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高可能成為糖尿病視網(wǎng)膜動(dòng)脈異常收縮及功能異常的重要原因。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(11)：1013-1016]

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是發(fā)達(dá)國(guó)家主要致盲眼病[1-2]。隨著人們生活水平的日益提高，我國(guó)糖尿病患病率呈逐年升高趨勢(shì)[3-5]，糖尿病相關(guān)的眼底并發(fā)癥也成為我國(guó)人群低視力和致盲的重要因素。因此探索DR早期的發(fā)病機(jī)理，對(duì)指導(dǎo)未來(lái)制定合理的預(yù)防策略意義重大。

最近研究結(jié)果顯示，DR的視網(wǎng)膜動(dòng)脈血管的收縮和血流灌注的減少早于DR微血管病變的出現(xiàn)[6-7]。在DR發(fā)病初期，視網(wǎng)膜動(dòng)脈血管內(nèi)離子通道的異常改變是導(dǎo)致其異常收縮、血流動(dòng)力學(xué)紊亂的主要原因之一[8-9]，其中視網(wǎng)膜血管平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣離子激活鉀離子(large conductance Ca2+-activated K+channel，BK)通道的改變尤為重要。

熒光探針Fura-2/AM自1985年問(wèn)世以來(lái)[10]，已成為測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度最常用的化學(xué)熒光指示劑。而研究糖尿病發(fā)展過(guò)程中大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(retinal artery smooth muscle cells，RASMC)內(nèi)鈣離子濃度的變化，可以從一個(gè)方面反映BK通道功能的改變。因此本研究擬通過(guò)測(cè)定正常、糖尿病及DR大鼠RASMC中鈣離子濃度的變化，初步探索糖尿病發(fā)病進(jìn)程中視網(wǎng)膜動(dòng)脈異常受損的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和器材 選用8～12周齡、體質(zhì)量(200±30)g的健康SD大鼠(江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所動(dòng)物中心提供)，雌雄不拘。細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)定裝置由Olympus-IX71倒置顯微鏡，LAMBDA DG-4細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度熒光測(cè)定儀、灌流系統(tǒng)、Metaflur軟件分析系統(tǒng)(美國(guó)Molecular Devices公司)組成；其他儀器有SHZ-82水浴恒溫振蕩器、SANXIN PHB-3/pH計(jì)、FA1604電子天平、Olympus SZX10解剖顯微鏡、Olympus LG-PS2光源。

1.1.2 試劑和溶液組成 試劑：Ⅱ型膠原酶(Worthington公司生產(chǎn))，牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶、二硫蘇糖醇、胰蛋白酶抑制劑、彈性蛋白酶、Fura-2/AM、鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，生理鹽水溶液(江蘇恒瑞醫(yī)藥公司)。溶液組成(單位mmol·L-1)：保存液：NaCl 140、KCl 5、CaCl22、D-glucose 5、MgCl21.3、HEPES 10，NaOH調(diào)pH至7.3；D-Hanks液(單位g·L-1)：NaCl 8、KCl 5、Na2HPO40.13、KH2PO40.06、NaHCO30.35、酚紅0.02，用NaHCO3調(diào)pH至7.4。STZ溶液：臨用前將STZ溶于生理鹽水，制成濃度為50 g·L-1STZ溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與研究方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 造模采用最近研究報(bào)道的方法[11]，取40只正常SD大鼠，體質(zhì)量200 g左右，采用STZ 100 mg·kg-1腹腔內(nèi)注射，2周后測(cè)定大鼠血糖濃度，如血糖濃度低于3 g·L-1，等劑量STZ再次腹腔內(nèi)注射，當(dāng)血糖濃度持續(xù)高于3 g·L-1診斷為糖尿病，持續(xù)6個(gè)月后經(jīng)眼底熒光血管造影證實(shí)出現(xiàn)DR，作為DR組。同時(shí)選擇正常SD大鼠40只及單純形成糖尿病的大鼠40只分別用作正常對(duì)照組及單純糖尿病組。

1.2.2 處死動(dòng)物取眼球 以30 g·L-1戊巴比妥鈉3 mL腹腔內(nèi)注射麻醉[12]，頸椎脫臼法處死，用眼科鑷及眼科剪取下眼球，放入保存液中，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 分離視網(wǎng)膜動(dòng)脈 將取下的眼球置于瓊脂板上固定，在解剖顯微鏡下調(diào)好放大倍數(shù)及焦距。左手持眼科顯微無(wú)齒鑷，右手持Alcon 15°刀，沿睫狀體扁平部垂直刺入，劃開(kāi)一個(gè)約1/4圈的口子。右手換持角膜剪，沿著劃開(kāi)的口子將角膜剪開(kāi)，取下角膜，完整取出晶狀體，暴露玻璃體。調(diào)整放大倍數(shù)及焦距，在顯微鏡下找到視網(wǎng)膜動(dòng)脈，由中央發(fā)出呈放射狀，用眼科顯微無(wú)齒鑷小心分離出視網(wǎng)膜動(dòng)脈，盡量剔除周邊黏附的玻璃體，將分離出的視網(wǎng)膜動(dòng)脈置于1 mL EP管中。

1.2.4 消化視網(wǎng)膜動(dòng)脈 打開(kāi)水浴恒溫振蕩器，調(diào)節(jié)水溫至37 ℃，打開(kāi)振蕩開(kāi)關(guān)，放入含有視網(wǎng)膜動(dòng)脈和消化液的EP管。1號(hào)消化液含牛血清白蛋白1 mg及保存液1 mL，2號(hào)消化液含木瓜蛋白酶1.5 mg、二硫蘇糖醇1 mg及1號(hào)消化液1 mL，3號(hào)消化液含Ⅱ型膠原酶1 mg、胰蛋白酶抑制劑1 mg、彈性蛋白酶0.25 mg及1號(hào)消化液1 mL。按照1、2、3的順序，每步驟消化20 min，最后將消化后的組織置于含有1 mL保存液的EP管中，4 ℃冰箱保存，4～16 h內(nèi)使用。

1.2.5 正常及糖尿病大鼠RASMC內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定 取出分離好的細(xì)胞懸液，用微量移液器吹打，吸取200 μL至Olympus-IX71倒置顯微鏡的細(xì)胞池中，再加入D-Hanks液795 μL，約10 min后在顯微鏡下觀察，如果細(xì)胞數(shù)量適中，狀態(tài)良好，則加入1 mmol·L-1Fura-2/AM 5 μL，使Fura-2/AM在溶液中的終濃度為5 μmol·L-1，避光30 min。將負(fù)載好Fura-2/AM的RASMC溶液用D-Hanks液連續(xù)沖洗約10 min，然后在倒置顯微鏡下，每次選取一個(gè)或一個(gè)以上RASMC作為靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定。

打開(kāi)LAMBDA DG-4細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度熒光測(cè)定儀，設(shè)定熒光探針Fura-2/AM的激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm和380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm。在避光條件下，連續(xù)記錄單個(gè)或多個(gè)RASMC的熒光信號(hào)強(qiáng)度。將在340 nm和380 nm兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度吸收信號(hào)F340和F380儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理和分析，測(cè)定時(shí)記錄靜息狀態(tài)下熒光信號(hào)強(qiáng)度比值R(F340/F380)。熒光信號(hào)強(qiáng)度比值R的變化代表RASMCs內(nèi)鈣離子濃度的變化，使用公式[Ca2+]i=β×Kd×(R-Rmin)/(Rmax-R)(單位：nmol·L-1)可將熒光信號(hào)強(qiáng)度比值換算成細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度[10]，式中[Ca2+]i代表細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，β是與選定波長(zhǎng)有關(guān)的比例系數(shù)，β=F380 max/F380 min，其中F380 max和F380 min分別代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子飽和狀態(tài)下和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度為0 nmol·L-1時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，即Fura-2與鈣離子結(jié)合達(dá)飽和狀態(tài)及完全游離時(shí)，在380 nm激發(fā)光下細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度之比；Kd為Fura-2與Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù)，為224 nmol·L-1；R是不同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得的熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值；Rmax為加入10 g·L-1Triton X-100后測(cè)得的最大熒光信號(hào)強(qiáng)度比值(Rmax=F340 max/F380 max)；Rmin為加入10 mmol·L-1乙二胺四乙酸后，測(cè)得的最小熒光信號(hào)強(qiáng)度比值(Rmin=F340 min/F380 min)。在計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度之前，應(yīng)減去沒(méi)有負(fù)載Fura-2之前細(xì)胞本身的熒光強(qiáng)度[13-15]。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病成模情況 造模8周后，測(cè)得正常對(duì)照組和單純糖尿病組大鼠血糖水平分別為(6.77±0.18)mmol·L-1和(31.14±0.75)mmol·L-1，單純糖尿病組大鼠血糖水平顯著高于對(duì)照組，符合造模要求；正常對(duì)照組大鼠體質(zhì)量較造模前增加75.4%，而糖尿病大鼠體質(zhì)量比造模前降低了11.3%。糖尿病大鼠持續(xù)6個(gè)月飼養(yǎng)后經(jīng)眼底熒光血管造影確定成模(圖1)。

Figure 1 Fundus fluorescein angiography images of normal rats and rats with diabetic retinopathy.A：Fundus fluorescein angiography images of normal SD rat，large vascular walls were smooth，and the walls of small blood vessels were without leakage(arrows position)；B：Fundus fluorescein angiography images of SD rats with diabetic retinopathy，the position of the arrow was fluorescence retinal vascular leakage area 正常對(duì)照組和DR組SD大鼠眼底熒光造影圖。A：正常對(duì)照組SD大鼠眼底熒光血管造影圖片，大血管壁平滑，小血管壁無(wú)滲漏(箭頭所示)；B：DR組SD大鼠眼底熒光造影圖，箭頭所指位置為視網(wǎng)膜血管熒光滲漏區(qū)

2.2 分離的RASMC 在倒置顯微鏡下觀察急性分離的RASMC，低倍鏡下每個(gè)視野數(shù)量10～15個(gè)細(xì)胞，大多數(shù)RASMC呈蚯蚓狀，部分呈短桿狀，花生狀，形態(tài)各異。RASMC輪廓清晰，為存活狀態(tài)(圖2)。

2.3 正常對(duì)照組、單純糖尿病組及DR組大鼠RASMC中鈣離子濃度測(cè)定 利用Metafluor軟件實(shí)時(shí)輸出，DR組大鼠RASMC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度為(255±10)nmol·L-1，正常對(duì)照組(123±11)nmol·L-1和單純糖尿病組(152±23)nmol·L-1，三者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 2 RVSMC with earthworm-like(× 200) RASMC呈蚯蚓狀(×200)

3 討論

DR已經(jīng)成為重要的致盲眼病[1]，我國(guó)是糖尿病易患國(guó)家之一，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)糖尿病患病率由10 a前的3.2%上升到目前的6.07%，且仍持續(xù)上升，而糖尿病人群中DR平均患病率則高達(dá)50%[4-6]，預(yù)計(jì)到2025年我國(guó)因DR而致盲的患者將達(dá)到320萬(wàn)[7]。因此，探索DR早期預(yù)防和治療的方法顯得尤為迫切和重要。DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有研究報(bào)道，糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜血流動(dòng)力學(xué)異常早于DR發(fā)生，并與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DR病變前期即出現(xiàn)視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈及其分支的異常收縮，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血流灌注的減少，視網(wǎng)膜組織缺血缺氧[8]。病變繼續(xù)發(fā)展，在持續(xù)高血糖的影響下，視網(wǎng)膜血管功能和結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞，血管滲漏增加，視網(wǎng)膜組織缺血缺氧加劇，繼發(fā)一系列玻璃體視網(wǎng)膜增生性病變，最終導(dǎo)致失明。在上述過(guò)程中視網(wǎng)膜血管收縮和血流灌注的減少早于DR微血管病變的出現(xiàn)[7，9]。目前，糖尿病視網(wǎng)膜動(dòng)脈異常收縮的調(diào)控機(jī)制尚未明了，故研究糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜動(dòng)脈異常收縮的機(jī)制對(duì)DR的早期預(yù)防和治療具有重要意義。

BK通道是調(diào)節(jié)血管舒縮的重要離子通道。參與血管張力調(diào)節(jié)、神經(jīng)興奮和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等多種重要生理活動(dòng)。BK通道受細(xì)胞跨膜電壓和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)，當(dāng)跨膜電壓增加和(或)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，BK通道開(kāi)放，鉀離子外流，細(xì)胞膜復(fù)極，血管擴(kuò)張[16]。正常情況下，由于BK通道激活后鉀離子外流，產(chǎn)生超極化，因而抑制電壓依賴(lài)性鈣離子通道開(kāi)放，使鈣離子內(nèi)流減少，血管平滑肌舒張，故BK通道功能主要是參與血管擴(kuò)張。視網(wǎng)膜動(dòng)脈是發(fā)自頸內(nèi)動(dòng)脈的終末動(dòng)脈，其收縮與舒張的調(diào)節(jié)與視網(wǎng)膜病變密切相關(guān)。而RASMC是位于視網(wǎng)膜動(dòng)脈上的血管平滑肌細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化影響了細(xì)胞的收縮與舒張，從而影響了視網(wǎng)膜動(dòng)脈的收縮與舒張。

以往對(duì)細(xì)胞中鈣離子濃度的研究顯示細(xì)胞內(nèi)鈣超載被認(rèn)為是多種疾病病理狀態(tài)中造成細(xì)胞異常損傷的共同通路[17-18]。本次在對(duì)單純糖尿病大鼠和DR大鼠RASMC中鈣離子濃度的研究中同樣發(fā)現(xiàn)隨著糖尿病病程的發(fā)展RASMC中鈣離子濃度呈增高趨勢(shì)，根據(jù)測(cè)定程序計(jì)算出的DR大鼠視網(wǎng)膜RASMC內(nèi)鈣離子濃度較正常對(duì)照組和單純糖尿病組升高，三組鈣離子濃度的變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們推測(cè)，在糖尿病時(shí)，RASMC細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子增加，鈣活動(dòng)增多，因此單純糖尿病組及DR組的RASMC較正常對(duì)照組處于更易收縮的狀態(tài)，此即為糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜動(dòng)脈異常收縮的基礎(chǔ)。視網(wǎng)膜動(dòng)脈的異常收縮會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血流灌注的減少，視網(wǎng)膜組織缺血缺氧。病變繼續(xù)發(fā)展，在持續(xù)高血糖的影響下，視網(wǎng)膜血管功能和結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞，血管滲漏增加，視網(wǎng)膜組織缺血缺氧加劇，繼發(fā)一系列玻璃體視網(wǎng)膜增殖性病變，最終導(dǎo)致視功能永久性損傷。因此，糖尿病時(shí)RASMC內(nèi)鈣離子濃度升高可能是DR的前期改變及重要機(jī)制之一。

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date：Jul 2，2014

Accepted date：Aug 15，2014Foundation item：Natural Science Foundation of Jiangsu Province(No：SBK201222073)；Medical Center Joint Research Project(No：YGZX1206)From theDepartmentofOphthalmology，WuxiPeople’sHospitalAffiliatedNanjingMedicalUniversity(SHAO Jun，SUN Wei，YAO Yong，CAO Xia)，Wuxi214000，JiangsuProvince，China；HeartCenterofWuxiPeople’sHospitalAffiliatedNanjingMedicalUniversity(WANG Ru-Xin)，Wuxi214000，JiangsuProvince，China

Responsible author：YAO Yong，E-mail：pard1@126.com

Changes of calcium concentration in retinal artery smooth muscle cells of rats with diabetic retinopathy

SHAO Jun，SUN Wei，YAO Yong，WANG Ru-Xin，CAO Xia

large conductance Ca2+-actived K+channel；retinal artery smooth muscle cells；intracellular calcium ion concentration

Objective To investigate the changes of calcium concentration in retinal artery smooth muscle cells of rats with diabetic retinopathy.Methods Forty male SD rats were chosen，streptozotocin(100 mg·kg-1)-induced rat diabetic animal models were established successfully by intraperitoneal injection，and fundus fluorescein angiography was used to determine the establishment of diabetic retinopathy after 8 weeks as the diabetic retinopathy group.Another 40 normal SD rats and single DM rats were chosen as the normal group and DM group.Retinal artery smooth muscle cells were isolated by enzyme digestion.Fluorescence microscopy method was applied to determine the three mice retinal artery smooth muscle intracellular calciumion concentration，SPSS 17.0 software was used for analysis.Results After 8 weeks，the blood glucose levels in the control group and DM group were(6.77±0.18)mmol·L-1and(31.14 ±0.75)mmol·L-1，after the same conditions of 6 months，diabetic retinopathy model of SD rat were identified by fundus fluorescein angiography.The calcium concentration in rat retinal artery smooth muscle of the diabetic retinopathy (255±10)nmol·L-1，normal (123±11)nmol·L-1and diabetes group (152±23)nmol·L-1were significantly diffe-rent(P<0.05).Conclusion The increase of calcium concentration in retinal artery smooth muscle cells with diabetic retinopathy may be an important cause of diabetic retinal artery abnormal contraction and dysfunction.

邵珺，孫尉，姚勇，王如心，曹葭.糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中鈣離子濃度的變化[J].眼科新進(jìn)展，2014，34(11)：1013-1016.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0281

邵珺，女，1983年10月出生，碩士，主治醫(yī)師。聯(lián)系電話：13665138176;E-mail：shaojun1983@hotmail.com

About SHAO Jun：Female，born in October，1983.Master degree.Attending doctor.Tel：13665138176；E-mail：shaojun1983@hotmail.com

2014-07-02

江蘇省自然科學(xué)基金(編號(hào)：SBK201222073)；醫(yī)管中心聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：YGZX1206)

214000 江蘇省無(wú)錫市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院眼科(邵珺，孫尉，姚勇，曹葭)；214000江蘇省無(wú)錫市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院心臟中心(王如心)

姚勇，E-mail：pard1@126.com

修回日期：2014-08-15

本文編輯：董建軍

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1013-1016]