高效液相色譜法測定小兒腹瀉凝膠膏中吳茱萸堿及吳茱萸次堿含量

秦海軍，張 毅，馬 玲，陳師農(nóng)，任燕茹

(1. 安徽省藥物研究所，安徽 合肥 230022; 2. 安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥 230022;3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

小兒腹瀉凝膠膏是民間治療小兒腹瀉的有效驗方，由吳茱萸、肉桂、蒼術(shù)、黃連、丁香等7 味中藥組方，有健脾益腎、去濕止瀉的功效，用于治療小兒腹瀉(脾腎陽虛證)所致大便稀溏、完谷不化、形體消瘦、面目虛浮、四肢欠溫、舌苔白膩、脈細無力。方中吳茱萸溫中止嘔、助陽止瀉、溫散脾寒，肉桂補火助陽、引火歸源，二藥合用健脾溫中，以治其本，共為君藥;蒼術(shù)燥濕健脾，厚樸導(dǎo)滯化濕，炮姜溫中散寒，三藥共為臣藥，為增強君藥之溫中散寒的功效，其余均為佐藥。本方配伍以健脾溫中、散寒止瀉為主，同時輔以祛濕、止瀉，有補虛而不留邪、標(biāo)本兼顧之效。為有效控制小兒腹瀉凝膠膏質(zhì)量，建立一種針對有效成分簡便、準(zhǔn)確的定量測定方法，對于該產(chǎn)品的質(zhì)控十分必要。吳茱萸為方中君藥，含有主要有生物堿類、苦味素類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎、止瀉及降血壓等作用[2]。本試驗中建立了小兒腹瀉凝膠膏中吳茱萸堿及吳茱萸次堿的含量測定方法，為更好控制小兒腹瀉凝膠膏質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2695 型高效液相色譜儀(四元泵，Waters 2998 型紫外檢測器);天津奧特塞斯AT-130 型柱溫箱;TU-1810 型紫外分光光度計;AR1140 型電子天平。吳茱萸堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110802 -200606，供含量測定用);吳茱萸次堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110801 -201006，供含量測定用);小兒腹瀉凝膠膏樣品(安徽省藥物研究所自制，批號為120308，120309，120311);甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果[3 -6]

2.1 色譜條件

色譜柱:Cosmosil 5 C18-MS-Ⅱ柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(51 ∶49);檢測波長:225 nm;柱溫:25 ℃;流量:1.0 mL/min，理論板數(shù)按吳茱萸堿峰計應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液制備

精密稱取吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品，加甲醇分別制成每1 mL 含吳茱萸堿0.089 mg、吳茱萸次堿0.025 mg 的溶液，搖勻，即得對照品溶液。取本品4 貼，剪成小塊，揭去蓋襯，精密稱定4 g，剪碎置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方量制備缺吳茱萸的空白樣品，按供試品溶液制備方法制備吳茱萸陰性對照品溶液備用。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:分別精密吸取2.2 項下3 種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按吳茱萸堿峰計不低于3 000。陰性對照品溶液色譜中，在吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰位置未見峰出現(xiàn)，認為陰性無干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:稱取吳茱萸堿約2.23 mg 與吳茱萸次堿對照品約1.92 mg，精密稱定，分別置25 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，分別精密吸取吳茱萸堿溶液和吳茱萸次堿溶液1 mL 和2 mL 置10 mL 容量瓶中，0.5，1.0，1.5 mL 置2 mL 容量瓶中，分別用甲醇稀釋至刻度，精密吸取上述溶液各10 μL，按擬訂色譜條件依法進樣測定，記錄峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、吳茱萸堿和吳茱萸次堿質(zhì)量濃度( X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，吳茱萸堿為Y =6.0 ×107X -13 702，r=0.999 9( n =5);吳茱萸次堿為 Y =9.4 ×107X +18 236，r=0.999 9( n=5)。結(jié)果表明，吳茱萸堿和吳茱萸次堿進樣量分別在0.089 ～0.89 μg 和0.077 ～0.768 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗:取同一吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品溶液，按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6 次，每次10 μL，記錄吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿的RSD 分別為0.67%和0.71%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗:取同一批樣品(批號為120308)共6 份，依法制備供試品溶液，精密量取該溶液和對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀，依法測定。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均總含量為每片0.532 mg，RSD 為0.85% ( n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗:按2.2 項下方法制備供試品溶液，每隔一定時間按擬訂色譜條件重復(fù)測定1 次，記錄吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積。結(jié)果吳茱萸堿峰面積的RSD 為1.11%，吳茱萸次堿峰面積的RSD 為1.32%，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗:取已知含量的同一批樣品(批號為120308)2.0 g，精密稱定共6 份，置具塞錐形瓶中，再分別加入?yún)擒镙菈A和吳茱萸次堿對照品適量，按供試品制備方法制備待測溶液。精密量取該溶液10 μL，按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀，依法測定。結(jié)果見表1。

表1 吳茱萸堿和吳茱萸次堿加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，依法制備供試品溶液，并按擬訂方法進樣測定。結(jié)果批號為120308，120309，120311 的3 批樣品中吳茱萸堿的平均含量為每貼0.518，0.520，0.519 mg，吳茱萸次堿的平均含量為每貼0.526，0.526，0.501 mg。

3 討論

預(yù)試驗時，參考文獻[7]及《中國藥典》[8]中吳茱萸項下含量測定方法，對流動相配比進行了比較，結(jié)果表明，以乙腈-水(51 ∶49)為流動相系統(tǒng)最佳，色譜峰的分離度、峰形都較好。

本試驗試用了甲醇、無水乙醇和80%乙醇等為提取溶劑，結(jié)果表明，以80%乙醇作為提取溶劑，吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量最高，故選擇80%乙醇為提取溶劑。

曾比較了80%乙醇回流30，45 min，80%乙醇超聲30，45 min，結(jié)果以超聲30 min 提取為最佳，可完全提取出吳茱萸堿和吳茱萸次堿，故選擇超聲30 min。本試驗方法能夠較好地控制小兒腹瀉凝膠膏中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，可作為控制該產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)。

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