高效液相色譜法測(cè)定清宮長(zhǎng)春膠囊中芍藥苷含量

李 君，黨曉偉，黃飛龍，商春麗

(1. 頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 承德 067000; 2. 河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北 承德 067000;3. 承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河北 承德 067000)

清宮長(zhǎng)春膠囊是頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)的具有延緩衰老、補(bǔ)益強(qiáng)壯作用的方藥，系根據(jù)清代宮廷成方長(zhǎng)春益壽丹研制而成，1999 年2 月經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)列為國(guó)家二級(jí)中藥保護(hù)品種。該藥由人參、當(dāng)歸、白芍、天冬、牛膝、茯苓、五味子、石菖蒲、枸杞子、麥冬、生熟地、遠(yuǎn)志、覆盆子、杜仲、木香、花椒、菟絲子、地骨皮、山藥、山茱萸、柏子仁、澤瀉、肉叢蓉共24 味藥組方，具有補(bǔ)腎益精、強(qiáng)筋壯骨、延緩衰老之功效，治療神衰體弱、精力不足、健忘易倦、頭暈耳鳴、腰痛膝軟、性欲減退、畏寒肢冷。為更好地控制該制劑質(zhì)量，結(jié)合相關(guān)研究[1-15]，在原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)清宮長(zhǎng)春膠囊中芍藥苷進(jìn)行定量分析，從而為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供客觀的定量評(píng)價(jià)方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC-10A 型高效液相色譜儀，包括島津LC-10AT 泵、SPD-M10A 型二級(jí)管陣列檢測(cè)器、CLASS-LC10 色譜工作站(日本);AL104 型萬(wàn)分之一分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);AE240 型十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士Mettler 公司);KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。清宮長(zhǎng)春膠囊(頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司);芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)為110736 -200526);乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1% 磷酸溶液(25 ∶75);流速:1.0 mL /min;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:35 ℃。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000，在此條件下，色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖

精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 mL 含80 μg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物20 粒，研細(xì)，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取按制劑處方比例及工藝制備不含白芍藥材的陰性對(duì)照品，取陰性對(duì)照品，依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取芍藥苷對(duì)照品20.1 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，備用。精密吸取上述對(duì)照品溶液(0.402 g/L)0.2，0.5，0.8，1.0，1.5，2.0，3.0 mL，分別置5 mL 容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，得芍藥苷質(zhì)量濃度為16.08，40.2，64.32，80.4，120.6，160.8，241.2 μg/mL 的溶液。精密吸取上述溶液10 μL 注入液相色譜儀，按色譜條件測(cè)定芍藥苷的峰面積，以峰面積Y 對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y =10 783 X +25 933( r =0.999 5)。結(jié)果表明，芍藥苷質(zhì)量濃度在16.08 ～241.2 μg /mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果的RSD=0.9%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)各進(jìn)樣1 次，每次10 μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果的RSD=1.02% ( n=6)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為291260)，取樣9 份，分為3 組，每組分別為1.6，2.0，2.4 g，分別精密稱定，按2.2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，測(cè)定芍藥苷峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為0.275 mg/粒，RSD 為1.85%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)為291260，含量為0.275 mg/粒)，研細(xì)，分別稱取9 份，每份1.0 g，分為3組，置具塞錐形瓶中，精密加入不同量的對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，測(cè)定芍藥苷的峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取6 個(gè)批號(hào)的樣品，依法測(cè)定。結(jié)果批號(hào)為291261，291262，291263，291245，291205，291206 的6 批樣品中芍藥苷的含量分別為0.275，0.274，0.276，0.268，0.259，0.266 mg/粒。

表1 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n=9)

3 討論

用紫外分光光度計(jì)對(duì)芍藥苷對(duì)照品溶液在200 ～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在230 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故選該波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

先后考察多種提取方法對(duì)本品提取效果的影響，試驗(yàn)證明，超聲處理方法和加熱回流提取方法所得芍藥苷較高，而超聲提取方法所得雜質(zhì)少，并減少了色譜柱的污染，故最終選擇超聲提取。同時(shí)對(duì)不同超聲時(shí)間(30，45，60 min)的提取效果進(jìn)行了考察，結(jié)果超聲提取時(shí)間45 min 時(shí)提取效果最好，故選擇超聲提取45 min，參照2010 年版《中國(guó)藥典(一部)》方法，分別用甲醇和乙醇提取，根據(jù)過(guò)濾時(shí)的難易程度和所得色譜峰的情況以及回收率測(cè)定結(jié)果，確認(rèn)用甲醇提取的效果更好。

用高效液相色譜法測(cè)定清宮長(zhǎng)春膠囊中白芍主要成分芍藥苷的含量，出峰時(shí)間適宜，陰性對(duì)照無(wú)干擾，樣品峰形和分離效果好。因此，高效液相色譜法方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

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