高效液相色譜法測定延腎膠囊中淫羊藿苷含量

王 芳，石 悅，曹 健

(中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400037)

延腎膠囊是我院研制的非標(biāo)準(zhǔn)制劑，由淫羊藿、大黃、三七、黃芪、川芎、當(dāng)歸、生地、白芍等8 味中藥材經(jīng)加工制成的復(fù)方制劑，具有活血化瘀、生血止血、利水滲濕等功效，臨床主要用于治療慢性腎炎、慢性腎功能衰竭1 至3 期、急性腎功能衰竭恢復(fù)期。為控制膠囊質(zhì)量，筆者以方中主藥淫羊藿的主要成分淫羊藿苷為指標(biāo)，參考有關(guān)文獻[1-5]，用高效液相色譜(HPLC)法測定延腎膠囊中淫羊藿苷含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 600 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司);ME235s型電子天平(德國Sartorius);CSF-1A 型超聲波發(fā)生器(上海超聲波儀器廠)。淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110737 -200312);延腎膠囊(0.45 g/粒，自制，批號分別為120629，120925，121108);缺淫羊藿的陰性對照膠囊(自制);乙腈為色譜純，水為超純水(自制)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS 柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(25 ∶75);檢測波長:270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:20 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取淫羊藿苷對照品10.0 mg，置50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2.5 mL 置25 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得每1mL 含淫羊藿苷0.02 mg 的對照品溶液。取本品10 粒，精密稱定，取膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，稱取細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加50%乙醇20 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，加50%乙醇至刻度，搖勻，過濾，精密吸取續(xù)濾液10 mL，置水浴上蒸干，加水10 mL 溶解，以乙酸乙酯萃取3 次，每次10 mL，合并乙酸乙酯萃取液，揮干，殘渣用50%乙醇溶解轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，并用50%乙醇定容至刻度，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺淫羊藿的陰性對照品，取其內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備缺淫羊藿的陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗:取2.2 項下3 種溶液，分別進樣20 μL，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果表明，陰性對照品溶液對樣品中淫羊藿苷的測定幾乎無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密稱取淫羊藿苷對照品10.0 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，置25 mL 容量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程A =43 132 C -5 996.5，r =0.999 8(n =5)。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在12.0 ～28.0 μg /mL 范圍內(nèi)與峰面積值線性關(guān)系良好。

精密度試驗:取淫羊藿苷對照品溶液，重復(fù)進樣5 次，測定淫羊藿苷峰面積。結(jié)果平均峰面積為858 119，RSD =0.25%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗:取同一批(批號為121108)供試品5 份，按供試品溶液的制備方法制備溶液，每次進樣20 μL，測定峰面積，計算含量。結(jié)果淫羊藿苷平均含量為2.503 mg/g，RSD=2.01%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液20 μL，于0，1，2，4，8 h 時進樣，記錄每次進樣的峰面積。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD =1.28%(n=5)，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗:取已知淫羊藿苷含量(2.503 mg/g)的樣品(批號為121108)約0.25 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.2 g/L 的淫羊藿苷對照品溶液3.0 mL，用供試品溶液制備方法制備溶液，按上述色譜條件測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收試驗結(jié)果( n=6)

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，依法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL 進樣，測定峰面積，計算淫羊藿苷的含量。結(jié)果批號為120629，120925，121108 的樣品，每粒中淫羊藿苷平均含量分別為0.927，0.905，1.126 mg(n=3)。

3 討論

延腎膠囊為中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，本試驗以淫羊藿苷作為含量測定指標(biāo)。通過紫外掃描，結(jié)果淫羊藿苷對照品溶液在270 nm 波長處有最大吸收，故選270 nm 為測定波長。

[1-4]選用乙腈-水作為流動相，50%乙醇作為提取溶劑，經(jīng)多次試驗，以乙腈-水(25 ∶75)為流動相時分離效果較好。在供試品溶液的制備過程中，對回流提取法、超聲提取法及提取時間15，30，45，60 min 分別進行了比較，結(jié)果兩種提取方法結(jié)果無顯著差異，提取時間30 min 便可提取完全，故選用操作簡便的超聲提取法提取30 min。又因超聲提取法提取的雜質(zhì)較多，本試驗根據(jù)淫羊藿苷的溶解性質(zhì)[5]再將提取液以乙酸乙酯提取、純化，結(jié)果能使提取的雜質(zhì)大為減少。

采用高效液相色譜法測定延腎膠囊中淫羊藿苷的含量，方法簡便易行，重現(xiàn)性好，可用于延腎膠囊的質(zhì)量控制。

參考文獻:

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[5] 楊 云，馮衛(wèi)生. 中藥化學(xué)成分提取分離手冊[M]. 北京:中國中醫(yī)藥出版社，1998:329.