均勻設(shè)計(jì)在釀酒酵母電轉(zhuǎn)化條件研究中的應(yīng)用

張啟聲+李珺+王翠峰+蔡祿

摘要：電穿孔方法是一種高效導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)。通過(guò)電轉(zhuǎn)化法對(duì)酵母YPH 500進(jìn)行外源DNA轉(zhuǎn)化，研究了電轉(zhuǎn)化中各因素對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA濃度、感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化率有明顯影響。采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，利用逐步回歸方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析， 結(jié)果表明，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度在1 750 V，酵母OD 600 nm在1.3，外源DNA濃度為7.5 mg/L時(shí)，酵母轉(zhuǎn)化率較高，約為24×102轉(zhuǎn)化子數(shù)/μg DNA。

關(guān)鍵詞：電轉(zhuǎn)化；釀酒酵母；均勻設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)：Q785；S963.32+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）03-0693-04

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種模式生物，常常作為表達(dá)系統(tǒng)。近些年，研究者常利用它進(jìn)行外源基因的表達(dá)或其他基因操作技術(shù)，所以外源基因的導(dǎo)入是進(jìn)行試驗(yàn)的先決條件。20世紀(jì)80年代，研究者開始利用電轉(zhuǎn)化法將外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該方法現(xiàn)已成為常用方法[1，2]。在轉(zhuǎn)化時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果往往受感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)、外源DNA濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度等多個(gè)條件的影響，需要探索最佳電轉(zhuǎn)化率的條件。但其中涉及多因素、多水平的試驗(yàn)，常規(guī)探索性試驗(yàn)工作量較大。均勻設(shè)計(jì)具有試驗(yàn)次數(shù)少，信息量大的優(yōu)點(diǎn)，只需做少量試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型，就可得到最佳的配比。本試驗(yàn)將穿梭質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化到釀酒酵母YPH 500中，從中考察電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA濃度和酵母細(xì)胞不同的生長(zhǎng)狀態(tài)下3個(gè)因素對(duì)電轉(zhuǎn)化的影響，以期為釀酒酵母電轉(zhuǎn)化的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 釀酒酵母YPH 500（遺傳背景：MATα ura3-52 lys2-801anber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、穿梭質(zhì)粒pRS405由美國(guó)新澤西州醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與分子遺傳學(xué)部Carol S. Newlon教授贈(zèng)送。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖（固體培養(yǎng)基瓊脂含量1.5%）。SD篩選培養(yǎng)基：1.34%YNB，2%葡萄糖，2%瓊脂，氨基酸（ade、ure、trp、his、lys，均為20 mg/L），SD全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：在SD篩選培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加100 mg/L leu。

1.1.3 試劑與主要儀器 1 mol/L山梨醇（南京博爾迪生物科技有限公司）；DP103型小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。2510型電轉(zhuǎn)儀、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海馳唐電子有限公司）；紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Merinton公司）；光學(xué)顯微鏡[OLYMPUS（中國(guó)）有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母YPH 500生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將凍存菌種在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)3～4 d。立即挑取單菌落接種于含有100 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)。每隔2 h取樣測(cè)定OD600 nm值，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。繪制酵母菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 外源DNA的制備 在穿梭質(zhì)粒pRS405上搭載酵母ARS304片段，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中儲(chǔ)存。采用DP103型小提試劑盒提取pRS405- ARS304質(zhì)粒。將所得產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒含量。

1.2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備 挑取活化好的酵母單菌落接種于含有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃ 180 r/min培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的細(xì)胞冰上放置10 min，倒入50 mL離心管中，4 ℃、1 300 r/min離心5 min。去掉培養(yǎng)液，用50 mL預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸，重復(fù)此步驟，洗滌2遍。再加入10 mL冰冷的1 mol/L山梨醇重懸菌體。最后加入1 mL冰冷的1 mol/L山梨醇。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化單因素驗(yàn)證 將制備好的不同時(shí)期感受態(tài)細(xì)胞、外源DNA分別混勻進(jìn)行以下處理，電轉(zhuǎn)化體系均為60 μL。①外源DNA 濃度5.0 mg/L，取不同感受態(tài)細(xì)胞的OD600 nm（0.2、0.4、0.7、1.1、1.3、1.4、1.5）進(jìn)行處理，感受態(tài)細(xì)胞用量80 μL，電場(chǎng)強(qiáng)度1 500 V；②感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm為 1.1，用量為80 μL，取不同外源DNA濃度（0.25、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mg/L ）進(jìn)行處理，電場(chǎng)強(qiáng)度1 500 V；③感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm 為1.1，外源DNA濃度5.0 mg/L，取不同電場(chǎng)強(qiáng)度（600、900、1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 V）進(jìn)行處理。將反應(yīng)液在冰上加入到空管中混勻，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。

1.2.5 電轉(zhuǎn)化均勻試驗(yàn) 確定所要研究的感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)、外源DNA濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度3個(gè)因素的不同水平，根據(jù)均勻設(shè)計(jì)[2]進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.2.6 電轉(zhuǎn)化效果評(píng)價(jià) 將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入1 mol/L 冰冷的山梨醇溶液中進(jìn)行洗滌。高速離心5 s去部分上清，輕柔混勻后涂布于SD篩選培養(yǎng)基上。每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)，其中對(duì)照組分別涂布于SD 篩選培養(yǎng)基和SD全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上。30 ℃培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計(jì)平板菌落個(gè)數(shù)。計(jì)算轉(zhuǎn)化率，評(píng)價(jià)每組試驗(yàn)效果[3]，其定義如下：

轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化子/外源DNA量×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源DNA的制備

將酵母YPH 500中的ARS304片段進(jìn)行克隆，通過(guò) BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切后搭載于穿梭質(zhì)粒pRS405上形成pRS405-ARS，該質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1所示。

在轉(zhuǎn)化時(shí)，環(huán)狀質(zhì)粒線性化便于整合到宿主細(xì)胞基因組中從而提高轉(zhuǎn)化率[4]。pRS405作為穿梭質(zhì)粒，在一定條件下可以帶ARS304自由穿梭于原核生物和真核生物中，ARS（Autonomously replicating sequence）為酵母染色質(zhì)復(fù)制所依賴的順式作用元件，ARS序列可提高導(dǎo)入質(zhì)粒的復(fù)制活性，減少質(zhì)粒丟失率，同時(shí)少部分可整合到基因組中并隨基因組復(fù)制，所以目的基因不需要線性化。該質(zhì)粒攜帶有亮氨酸基因，可在亮氨酸缺陷性酵母菌株中篩選。

2.2 酵母YPH 500生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由酵母YPH 500細(xì)胞數(shù)量和OD600 nm可以看出（圖2），在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)，酵母YPH 500在16～26 h可達(dá)到對(duì)數(shù)期，其OD600 nm為0.2～1.5，酵母YPH 500數(shù)量約為3.86×1011～5.04×1012個(gè)/mL。其中在28 h之后酵母數(shù)量與OD600 nm沒(méi)有相關(guān)性。

2.3 酵母YPH 500不同的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)電轉(zhuǎn)化效果的影響

酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響主要是由于分裂時(shí)酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。在電壓1 500 V、外源DNA濃度5.0 mg/L的條件下，取處于不同階段（OD600 nm為0.2～1.5）的酵母YPH 500感受態(tài)細(xì)胞80 μL進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同階段的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響差異較大，在對(duì)數(shù)初期和對(duì)數(shù)末期效率較低，是由于在初期菌量較少，外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的概率較小，而在對(duì)數(shù)末期其細(xì)胞壁較為致密不利于電穿孔。所以酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)主要受2個(gè)因素控制，即細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。其中OD600 nm為1.3時(shí)的酵母YPH 500細(xì)胞電轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到19.5×102轉(zhuǎn)化子數(shù)/μg DNA（圖3）。

2.4 外源DNA濃度對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化效果的影響

在電壓為1 500 V，感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm為1.1，用量為80 μL的條件下，分別加入不同濃度的外源DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)外源DNA濃度在7.5 mg/L時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，但在2.5～10.0 mg/L 的范圍內(nèi)其轉(zhuǎn)化率差異較小。當(dāng)外源DNA濃度較少時(shí)，有效電擊會(huì)減少[6]，而當(dāng)量多時(shí)反應(yīng)原理尚未弄清。有研究者猜想[7]可能是由于DNA較多時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞表面點(diǎn)位造成影響或者是由于堵塞轉(zhuǎn)化孔道所致。當(dāng)外源DNA量低于2.5 mg/L或高于10.0 mg/L時(shí)其轉(zhuǎn)化率明顯下降。本試驗(yàn)中，外源DNA在一定范圍內(nèi)（2.5～10.0 mg/L）酵母電轉(zhuǎn)化率變化不大，而超出此范圍，轉(zhuǎn)化率則明顯減少。

2.5 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化效果的影響

采用1 mm寬度的電轉(zhuǎn)化杯，在OD600 nm為1.1的感受態(tài)細(xì)胞，用量為80 μL，外源DNA 濃度5.0 mg/L的條件下，分別施以不同的電壓進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖5所示。在不同電壓下酵母轉(zhuǎn)化率差異較大，其中在電場(chǎng)強(qiáng)度為1 500 V時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，1 800 V時(shí)次之，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度大于1 800 V時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞形成難以自愈的較大孔道，細(xì)胞內(nèi)大分子容易溢出，造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)化率下降。而當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)小時(shí)，在細(xì)胞表面形成的孔道較小，外源DNA難以進(jìn)入，使轉(zhuǎn)化率降低。在本試驗(yàn)中電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響較為明顯，其閾值范圍較?。? 500～1 800 V），超出此范圍，酵母轉(zhuǎn)化率明顯降低。

2.6 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步探討電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA濃度、感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)3個(gè)參數(shù)及其交互作用對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化率的影響，以轉(zhuǎn)化率為考核指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

利用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析處理，得到轉(zhuǎn)化率與各因素的回歸方程為：Y=321.4+46.75X1-32.54X2-12.9X3-26.151X12+103.48X22+1 343.5X32。其中相關(guān)系數(shù)R為0.999 9，F(xiàn)值為987，作F 檢驗(yàn)，F(xiàn)>F0.05（8，1）=238.9，回歸方程顯著。將試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)通過(guò)回歸方程進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3所示，觀測(cè)值與擬合值誤差較小，準(zhǔn)確度高。通過(guò)單因素分析，其通徑系數(shù)為X1（0.827 6）>X3（-0.364 9）>X2（-0.283 4）。在3個(gè)參數(shù)中，感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響最大，電場(chǎng)強(qiáng)度次之，外源DNA濃度最小。通過(guò)對(duì)回歸方程進(jìn)行極值分析，發(fā)現(xiàn)酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm為1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度為1 750 V，外源DNA濃度為7.5 mg/L時(shí)可得到較高的電轉(zhuǎn)化效率，約為24×102轉(zhuǎn)化子數(shù)/μg DNA。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA濃度、感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化率的影響較大，其中酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm達(dá)到1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)1 500～1 800V，DNA濃度達(dá)到7.5 mg/L時(shí)可在各自水平中取得較好的試驗(yàn)結(jié)果。

對(duì)以上3個(gè)因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，研究各因素的交互作用對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響，發(fā)現(xiàn)3個(gè)因素對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響各不相同，感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)影響最大，電場(chǎng)強(qiáng)度次之，外源DNA濃度最小。通過(guò)對(duì)回歸方程的極值運(yùn)算，可預(yù)測(cè)酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm達(dá)到1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到1 750 V，外源DNA濃度達(dá)到7.5 mg/L時(shí)可得到較高的電轉(zhuǎn)化效率。本研究結(jié)果表明電轉(zhuǎn)化效率的條件優(yōu)化利用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)簡(jiǎn)單、可信度較高。如果加入其他條件的研究，將大大降低試驗(yàn)組數(shù)，節(jié)省試驗(yàn)材料。

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在轉(zhuǎn)化時(shí)，環(huán)狀質(zhì)粒線性化便于整合到宿主細(xì)胞基因組中從而提高轉(zhuǎn)化率[4]。pRS405作為穿梭質(zhì)粒，在一定條件下可以帶ARS304自由穿梭于原核生物和真核生物中，ARS（Autonomously replicating sequence）為酵母染色質(zhì)復(fù)制所依賴的順式作用元件，ARS序列可提高導(dǎo)入質(zhì)粒的復(fù)制活性，減少質(zhì)粒丟失率，同時(shí)少部分可整合到基因組中并隨基因組復(fù)制，所以目的基因不需要線性化。該質(zhì)粒攜帶有亮氨酸基因，可在亮氨酸缺陷性酵母菌株中篩選。

2.2 酵母YPH 500生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由酵母YPH 500細(xì)胞數(shù)量和OD600 nm可以看出（圖2），在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)，酵母YPH 500在16～26 h可達(dá)到對(duì)數(shù)期，其OD600 nm為0.2～1.5，酵母YPH 500數(shù)量約為3.86×1011～5.04×1012個(gè)/mL。其中在28 h之后酵母數(shù)量與OD600 nm沒(méi)有相關(guān)性。

2.3 酵母YPH 500不同的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)電轉(zhuǎn)化效果的影響

酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響主要是由于分裂時(shí)酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。在電壓1 500 V、外源DNA濃度5.0 mg/L的條件下，取處于不同階段（OD600 nm為0.2～1.5）的酵母YPH 500感受態(tài)細(xì)胞80 μL進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同階段的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響差異較大，在對(duì)數(shù)初期和對(duì)數(shù)末期效率較低，是由于在初期菌量較少，外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的概率較小，而在對(duì)數(shù)末期其細(xì)胞壁較為致密不利于電穿孔。所以酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)主要受2個(gè)因素控制，即細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。其中OD600 nm為1.3時(shí)的酵母YPH 500細(xì)胞電轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到19.5×102轉(zhuǎn)化子數(shù)/μg DNA（圖3）。

2.4 外源DNA濃度對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化效果的影響

在電壓為1 500 V，感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm為1.1，用量為80 μL的條件下，分別加入不同濃度的外源DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)外源DNA濃度在7.5 mg/L時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，但在2.5～10.0 mg/L 的范圍內(nèi)其轉(zhuǎn)化率差異較小。當(dāng)外源DNA濃度較少時(shí)，有效電擊會(huì)減少[6]，而當(dāng)量多時(shí)反應(yīng)原理尚未弄清。有研究者猜想[7]可能是由于DNA較多時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞表面點(diǎn)位造成影響或者是由于堵塞轉(zhuǎn)化孔道所致。當(dāng)外源DNA量低于2.5 mg/L或高于10.0 mg/L時(shí)其轉(zhuǎn)化率明顯下降。本試驗(yàn)中，外源DNA在一定范圍內(nèi)（2.5～10.0 mg/L）酵母電轉(zhuǎn)化率變化不大，而超出此范圍，轉(zhuǎn)化率則明顯減少。

2.5 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化效果的影響

采用1 mm寬度的電轉(zhuǎn)化杯，在OD600 nm為1.1的感受態(tài)細(xì)胞，用量為80 μL，外源DNA 濃度5.0 mg/L的條件下，分別施以不同的電壓進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖5所示。在不同電壓下酵母轉(zhuǎn)化率差異較大，其中在電場(chǎng)強(qiáng)度為1 500 V時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，1 800 V時(shí)次之，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度大于1 800 V時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞形成難以自愈的較大孔道，細(xì)胞內(nèi)大分子容易溢出，造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)化率下降。而當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)小時(shí)，在細(xì)胞表面形成的孔道較小，外源DNA難以進(jìn)入，使轉(zhuǎn)化率降低。在本試驗(yàn)中電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響較為明顯，其閾值范圍較小（1 500～1 800 V），超出此范圍，酵母轉(zhuǎn)化率明顯降低。

2.6 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步探討電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA濃度、感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)3個(gè)參數(shù)及其交互作用對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化率的影響，以轉(zhuǎn)化率為考核指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

利用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析處理，得到轉(zhuǎn)化率與各因素的回歸方程為：Y=321.4+46.75X1-32.54X2-12.9X3-26.151X12+103.48X22+1 343.5X32。其中相關(guān)系數(shù)R為0.999 9，F(xiàn)值為987，作F 檢驗(yàn)，F(xiàn)>F0.05（8，1）=238.9，回歸方程顯著。將試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)通過(guò)回歸方程進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3所示，觀測(cè)值與擬合值誤差較小，準(zhǔn)確度高。通過(guò)單因素分析，其通徑系數(shù)為X1（0.827 6）>X3（-0.364 9）>X2（-0.283 4）。在3個(gè)參數(shù)中，感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響最大，電場(chǎng)強(qiáng)度次之，外源DNA濃度最小。通過(guò)對(duì)回歸方程進(jìn)行極值分析，發(fā)現(xiàn)酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm為1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度為1 750 V，外源DNA濃度為7.5 mg/L時(shí)可得到較高的電轉(zhuǎn)化效率，約為24×102轉(zhuǎn)化子數(shù)/μg DNA。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA濃度、感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化率的影響較大，其中酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm達(dá)到1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)1 500～1 800V，DNA濃度達(dá)到7.5 mg/L時(shí)可在各自水平中取得較好的試驗(yàn)結(jié)果。

對(duì)以上3個(gè)因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，研究各因素的交互作用對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響，發(fā)現(xiàn)3個(gè)因素對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響各不相同，感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)影響最大，電場(chǎng)強(qiáng)度次之，外源DNA濃度最小。通過(guò)對(duì)回歸方程的極值運(yùn)算，可預(yù)測(cè)酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm達(dá)到1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到1 750 V，外源DNA濃度達(dá)到7.5 mg/L時(shí)可得到較高的電轉(zhuǎn)化效率。本研究結(jié)果表明電轉(zhuǎn)化效率的條件優(yōu)化利用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)簡(jiǎn)單、可信度較高。如果加入其他條件的研究，將大大降低試驗(yàn)組數(shù)，節(jié)省試驗(yàn)材料。

參考文獻(xiàn)：

[1] HASHIMOTO H， MORIJAWA H， YAMATA Y， et al. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA[J]. Applied Microbiol Biotechnol，1985， 21（5）：336-339.

[2] 方開泰.均勻設(shè)計(jì)與均勻設(shè)計(jì)表[M].北京：科學(xué)出版社，1994. 13-17.

[3] 劉秀蓮，王宇光，雷祿旺. 海洋紅酵母電轉(zhuǎn)化條件的研究[J].生命科學(xué)研究，2008，12（2）：136-140.

[4] 秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化率的條件[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，34（2）：236-240.

[5] BECHER D M， GUARENTE L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation[J]. Methods Enzymol，1991，194：182-187.

[6] MEIHOC E， MASSON J M， TEISSIE J. High efficiency transformation of intact yeast cellls by electric field pulses[J].Biotechnol，1990，8：223-227.

[7] HICKS J B， HINNEN A， FINK G P. Properties of Yeast Transformation[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1978.

在轉(zhuǎn)化時(shí)，環(huán)狀質(zhì)粒線性化便于整合到宿主細(xì)胞基因組中從而提高轉(zhuǎn)化率[4]。pRS405作為穿梭質(zhì)粒，在一定條件下可以帶ARS304自由穿梭于原核生物和真核生物中，ARS（Autonomously replicating sequence）為酵母染色質(zhì)復(fù)制所依賴的順式作用元件，ARS序列可提高導(dǎo)入質(zhì)粒的復(fù)制活性，減少質(zhì)粒丟失率，同時(shí)少部分可整合到基因組中并隨基因組復(fù)制，所以目的基因不需要線性化。該質(zhì)粒攜帶有亮氨酸基因，可在亮氨酸缺陷性酵母菌株中篩選。

2.2 酵母YPH 500生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由酵母YPH 500細(xì)胞數(shù)量和OD600 nm可以看出（圖2），在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)，酵母YPH 500在16～26 h可達(dá)到對(duì)數(shù)期，其OD600 nm為0.2～1.5，酵母YPH 500數(shù)量約為3.86×1011～5.04×1012個(gè)/mL。其中在28 h之后酵母數(shù)量與OD600 nm沒(méi)有相關(guān)性。

2.3 酵母YPH 500不同的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)電轉(zhuǎn)化效果的影響

酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響主要是由于分裂時(shí)酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。在電壓1 500 V、外源DNA濃度5.0 mg/L的條件下，取處于不同階段（OD600 nm為0.2～1.5）的酵母YPH 500感受態(tài)細(xì)胞80 μL進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同階段的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響差異較大，在對(duì)數(shù)初期和對(duì)數(shù)末期效率較低，是由于在初期菌量較少，外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的概率較小，而在對(duì)數(shù)末期其細(xì)胞壁較為致密不利于電穿孔。所以酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)主要受2個(gè)因素控制，即細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。其中OD600 nm為1.3時(shí)的酵母YPH 500細(xì)胞電轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到19.5×102轉(zhuǎn)化子數(shù)/μg DNA（圖3）。

2.4 外源DNA濃度對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化效果的影響

在電壓為1 500 V，感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm為1.1，用量為80 μL的條件下，分別加入不同濃度的外源DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)外源DNA濃度在7.5 mg/L時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，但在2.5～10.0 mg/L 的范圍內(nèi)其轉(zhuǎn)化率差異較小。當(dāng)外源DNA濃度較少時(shí)，有效電擊會(huì)減少[6]，而當(dāng)量多時(shí)反應(yīng)原理尚未弄清。有研究者猜想[7]可能是由于DNA較多時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞表面點(diǎn)位造成影響或者是由于堵塞轉(zhuǎn)化孔道所致。當(dāng)外源DNA量低于2.5 mg/L或高于10.0 mg/L時(shí)其轉(zhuǎn)化率明顯下降。本試驗(yàn)中，外源DNA在一定范圍內(nèi)（2.5～10.0 mg/L）酵母電轉(zhuǎn)化率變化不大，而超出此范圍，轉(zhuǎn)化率則明顯減少。

2.5 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化效果的影響

采用1 mm寬度的電轉(zhuǎn)化杯，在OD600 nm為1.1的感受態(tài)細(xì)胞，用量為80 μL，外源DNA 濃度5.0 mg/L的條件下，分別施以不同的電壓進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖5所示。在不同電壓下酵母轉(zhuǎn)化率差異較大，其中在電場(chǎng)強(qiáng)度為1 500 V時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，1 800 V時(shí)次之，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度大于1 800 V時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞形成難以自愈的較大孔道，細(xì)胞內(nèi)大分子容易溢出，造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)化率下降。而當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)小時(shí)，在細(xì)胞表面形成的孔道較小，外源DNA難以進(jìn)入，使轉(zhuǎn)化率降低。在本試驗(yàn)中電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響較為明顯，其閾值范圍較?。? 500～1 800 V），超出此范圍，酵母轉(zhuǎn)化率明顯降低。

2.6 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步探討電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA濃度、感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)3個(gè)參數(shù)及其交互作用對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化率的影響，以轉(zhuǎn)化率為考核指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

利用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析處理，得到轉(zhuǎn)化率與各因素的回歸方程為：Y=321.4+46.75X1-32.54X2-12.9X3-26.151X12+103.48X22+1 343.5X32。其中相關(guān)系數(shù)R為0.999 9，F(xiàn)值為987，作F 檢驗(yàn)，F(xiàn)>F0.05（8，1）=238.9，回歸方程顯著。將試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)通過(guò)回歸方程進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3所示，觀測(cè)值與擬合值誤差較小，準(zhǔn)確度高。通過(guò)單因素分析，其通徑系數(shù)為X1（0.827 6）>X3（-0.364 9）>X2（-0.283 4）。在3個(gè)參數(shù)中，感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響最大，電場(chǎng)強(qiáng)度次之，外源DNA濃度最小。通過(guò)對(duì)回歸方程進(jìn)行極值分析，發(fā)現(xiàn)酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm為1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度為1 750 V，外源DNA濃度為7.5 mg/L時(shí)可得到較高的電轉(zhuǎn)化效率，約為24×102轉(zhuǎn)化子數(shù)/μg DNA。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA濃度、感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)酵母電轉(zhuǎn)化率的影響較大，其中酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm達(dá)到1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)1 500～1 800V，DNA濃度達(dá)到7.5 mg/L時(shí)可在各自水平中取得較好的試驗(yàn)結(jié)果。

對(duì)以上3個(gè)因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，研究各因素的交互作用對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響，發(fā)現(xiàn)3個(gè)因素對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響各不相同，感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)影響最大，電場(chǎng)強(qiáng)度次之，外源DNA濃度最小。通過(guò)對(duì)回歸方程的極值運(yùn)算，可預(yù)測(cè)酵母感受態(tài)細(xì)胞OD600 nm達(dá)到1.3，電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到1 750 V，外源DNA濃度達(dá)到7.5 mg/L時(shí)可得到較高的電轉(zhuǎn)化效率。本研究結(jié)果表明電轉(zhuǎn)化效率的條件優(yōu)化利用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)簡(jiǎn)單、可信度較高。如果加入其他條件的研究，將大大降低試驗(yàn)組數(shù)，節(jié)省試驗(yàn)材料。

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