魔芋內(nèi)生拮抗菌的定殖研究

程海麗+陳磊+樂(lè)超銀

摘要：采用抗魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病的內(nèi)生芽孢桿菌BS-8發(fā)酵液灌根魔芋植株，定期測(cè)定該內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況。根據(jù)該內(nèi)生菌16S rRNA特異性保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，定期4次采樣，提取魔芋葉片DNA，通過(guò)SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)該內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況。結(jié)果表明，經(jīng)內(nèi)生拮抗菌灌根培養(yǎng)的魔芋葉片中芽孢桿菌數(shù)量均明顯大于對(duì)照，該內(nèi)生芽孢桿菌能大量定殖在魔芋葉片中。

關(guān)鍵詞：魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病；內(nèi)生拮抗菌；SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S632.9；TQ458 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）03-0613-04

魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌（Erwonia carotovora var. Carotovora）引起的一種細(xì)菌性病害[1]。該病原菌致病機(jī)理為病原菌分泌果膠酶，消解細(xì)胞中間層，使組織潰爛，吸引其他腐敗細(xì)菌寄生，分解細(xì)胞蛋白胨，產(chǎn)生吲哚[2]?？晌：λ惺只剖卟耍铱山惶?zhèn)魅?。在流行年份損失可達(dá)50%～60%，甚至絕收，因此對(duì)其進(jìn)行防治十分必要[3]。

近年來(lái)，生物防治已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[4]。生物防治有利于人畜安全及環(huán)境保護(hù)，它不僅成本低廉，且兼防兼治，可增產(chǎn)增收，是一種無(wú)公害植保新技術(shù)，倍受人們青睞[5]。植物內(nèi)生菌是指在植物生長(zhǎng)的一定或全部階段生活在植物體內(nèi)、但不表現(xiàn)出外在性狀的一類(lèi)微生物，通常存在于細(xì)胞間隙[6，7]。植物內(nèi)生菌作為生防因子的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在它能定殖于植物體內(nèi)，相對(duì)于其他環(huán)境微生物而言，避免了多種外界壓力的干擾，更有利于發(fā)揮生防效果。關(guān)于魔芋內(nèi)生菌定殖體內(nèi)的生防效果研究很少，因此，篩選出具有拮抗魔芋軟腐病的微生物是目前防治軟腐病的有效途徑。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR）技術(shù)是通過(guò)在反應(yīng)體系中添加熒光染料或熒光標(biāo)記特異性探針，在PCR反應(yīng)過(guò)程中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)控，通過(guò)收集的熒光信號(hào)強(qiáng)弱進(jìn)行定性或定量檢測(cè)和分析[8-10]。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR能準(zhǔn)確確定初始模板的拷貝數(shù)或濃度，靈敏度高，其擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，大大提高了試驗(yàn)效率。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能對(duì)植物樣品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，主要用于研究植物體內(nèi)有益微生物及病原菌的定量檢測(cè)、基因拷貝數(shù)檢測(cè)、目的基因表達(dá)水平差異檢測(cè)等，檢測(cè)范圍為101～1010拷貝數(shù)。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)生拮抗菌在魔芋植株中的定殖情況，以期為研究新的魔芋生防制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試灌根用菌為魔芋內(nèi)生拮抗菌芽孢桿菌BS-8，由三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心于2011年分離鑒定并保存，經(jīng)鑒定該菌抗魔芋軟腐病。培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基[11]。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將BS-8菌種涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。挑取一定體積的菌落置于含250 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，封口后放入搖床，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。檢測(cè)發(fā)酵液OD值，使其OD值為0.6，以備后面灌根用。

1.2.2 DNA的提取 挑取大小均勻、質(zhì)量約10 g的種芋播種于花盆中，待出苗后，以每盆100 mL內(nèi)生拮抗菌發(fā)酵液澆灌于魔芋植株根部，以澆灌自來(lái)水的作為空白對(duì)照，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)。待魔芋灌根處理后每隔15 d采1次樣，共采樣4次，樣品和空白對(duì)照每次做3次重復(fù)。DNA的提取采用CTAB法[12]。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與PCR檢測(cè) 將該內(nèi)生拮抗菌16S rRNA序列與同屬菌株進(jìn)行比對(duì)，尋找特異性區(qū)域，根據(jù)該區(qū)域設(shè)計(jì)引物。上游引物為FQ-5 5′-ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAG-3′和下游引物為FQ-3 5′-TCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCC-3′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為147 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1）構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。以BS-8菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25 μL）為DNA模板 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Primer 1和Primer 2各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，割膠回收后連接T載體，并將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

2）標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板2.0 μL，Primer 1和Primer 2各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 12.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，78 ℃ 孵育1 s，共39個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，溫度從60 ℃上升到95.5 ℃，直至PCR產(chǎn)物全部解鏈，溫度上升的幅度為0.3 ℃/s，每10 s檢測(cè)一次熒光信號(hào)，繪制PCR產(chǎn)物的溶解曲線、擴(kuò)增曲線圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以純化后的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)提取的質(zhì)粒濃度，計(jì)算其拷貝數(shù)[13]。

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個(gè)濃度梯度，拷貝數(shù)范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個(gè)濃度的質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度3次重復(fù)，同時(shí)以不加模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，自動(dòng)生成溶解曲線，并根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)DNA的Ct值及其起始拷貝數(shù)的log值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，構(gòu)建絕對(duì)定量。

4）內(nèi)生拮抗菌BS-8在魔芋體內(nèi)定殖情況的檢測(cè)。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系和條件同上，反應(yīng)結(jié)束后，將每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中，計(jì)算內(nèi)生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內(nèi)生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對(duì)照，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預(yù)期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物除第三次外均無(wú)此條帶。結(jié)果表明，常規(guī)PCR檢測(cè)到經(jīng)芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對(duì)照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內(nèi)。該內(nèi)生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達(dá)。

2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預(yù)期的條帶大小一致，PCR產(chǎn)物特異性強(qiáng)、條帶清晰，沒(méi)有明顯的二聚體產(chǎn)生。將擴(kuò)增的目標(biāo)片段與T載體連接，測(cè)序結(jié)果得到序列大小為147 bp。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，溶解曲線、擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線依次見(jiàn)圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說(shuō)明反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有其他非靶標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生，引物特異性強(qiáng)，產(chǎn)物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準(zhǔn)確。

由圖5可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.216 66，說(shuō)明反應(yīng)的Ct值與質(zhì)粒濃度的拷貝數(shù)log值成反比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.980 82，說(shuō)明不同拷貝數(shù)與其對(duì)應(yīng)的Ct值具有很高的相關(guān)性，準(zhǔn)確性好，能用于后續(xù)進(jìn)一步的熒光定量分析。

2.4 內(nèi)生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，熒光擴(kuò)增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應(yīng)的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算芽胞桿菌DNA拷貝數(shù)的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數(shù)量。

2.5 檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，利用Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出的拷貝數(shù)范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經(jīng)芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數(shù)量均明顯大于空白處理。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了魔芋內(nèi)生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數(shù)據(jù)不能說(shuō)明該內(nèi)生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關(guān)系，因此，需要后面繼續(xù)進(jìn)行研究，檢測(cè)該內(nèi)生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關(guān)系。另外，該定量方法并不能說(shuō)明所檢測(cè)的內(nèi)生菌數(shù)量全部是芽孢桿菌BS-8，因?yàn)槟в笕~片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說(shuō)熒光定量PCR檢測(cè)的定殖芽孢桿菌含量并不準(zhǔn)確，因?yàn)闊晒舛縋CR并不能進(jìn)行物種分類(lèi)，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會(huì)被檢測(cè)到，單純的16S rRNA引物并不能用來(lái)對(duì)特異的某種微生物進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，尤其在比較復(fù)雜的微生物體中，如果要進(jìn)行更精確的分析，應(yīng)采用探針?lè)ㄟM(jìn)行研究。

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將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個(gè)濃度梯度，拷貝數(shù)范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個(gè)濃度的質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度3次重復(fù)，同時(shí)以不加模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，自動(dòng)生成溶解曲線，并根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)DNA的Ct值及其起始拷貝數(shù)的log值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，構(gòu)建絕對(duì)定量。

4）內(nèi)生拮抗菌BS-8在魔芋體內(nèi)定殖情況的檢測(cè)。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系和條件同上，反應(yīng)結(jié)束后，將每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中，計(jì)算內(nèi)生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內(nèi)生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對(duì)照，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預(yù)期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物除第三次外均無(wú)此條帶。結(jié)果表明，常規(guī)PCR檢測(cè)到經(jīng)芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對(duì)照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內(nèi)。該內(nèi)生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達(dá)。

2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預(yù)期的條帶大小一致，PCR產(chǎn)物特異性強(qiáng)、條帶清晰，沒(méi)有明顯的二聚體產(chǎn)生。將擴(kuò)增的目標(biāo)片段與T載體連接，測(cè)序結(jié)果得到序列大小為147 bp。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，溶解曲線、擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線依次見(jiàn)圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說(shuō)明反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有其他非靶標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生，引物特異性強(qiáng)，產(chǎn)物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準(zhǔn)確。

由圖5可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.216 66，說(shuō)明反應(yīng)的Ct值與質(zhì)粒濃度的拷貝數(shù)log值成反比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.980 82，說(shuō)明不同拷貝數(shù)與其對(duì)應(yīng)的Ct值具有很高的相關(guān)性，準(zhǔn)確性好，能用于后續(xù)進(jìn)一步的熒光定量分析。

2.4 內(nèi)生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，熒光擴(kuò)增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應(yīng)的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算芽胞桿菌DNA拷貝數(shù)的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數(shù)量。

2.5 檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，利用Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出的拷貝數(shù)范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經(jīng)芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數(shù)量均明顯大于空白處理。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了魔芋內(nèi)生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數(shù)據(jù)不能說(shuō)明該內(nèi)生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關(guān)系，因此，需要后面繼續(xù)進(jìn)行研究，檢測(cè)該內(nèi)生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關(guān)系。另外，該定量方法并不能說(shuō)明所檢測(cè)的內(nèi)生菌數(shù)量全部是芽孢桿菌BS-8，因?yàn)槟в笕~片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說(shuō)熒光定量PCR檢測(cè)的定殖芽孢桿菌含量并不準(zhǔn)確，因?yàn)闊晒舛縋CR并不能進(jìn)行物種分類(lèi)，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會(huì)被檢測(cè)到，單純的16S rRNA引物并不能用來(lái)對(duì)特異的某種微生物進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，尤其在比較復(fù)雜的微生物體中，如果要進(jìn)行更精確的分析，應(yīng)采用探針?lè)ㄟM(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)：

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將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個(gè)濃度梯度，拷貝數(shù)范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個(gè)濃度的質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度3次重復(fù)，同時(shí)以不加模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，自動(dòng)生成溶解曲線，并根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)DNA的Ct值及其起始拷貝數(shù)的log值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，構(gòu)建絕對(duì)定量。

4）內(nèi)生拮抗菌BS-8在魔芋體內(nèi)定殖情況的檢測(cè)。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系和條件同上，反應(yīng)結(jié)束后，將每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中，計(jì)算內(nèi)生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內(nèi)生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對(duì)照，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預(yù)期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物除第三次外均無(wú)此條帶。結(jié)果表明，常規(guī)PCR檢測(cè)到經(jīng)芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對(duì)照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內(nèi)。該內(nèi)生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達(dá)。

2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預(yù)期的條帶大小一致，PCR產(chǎn)物特異性強(qiáng)、條帶清晰，沒(méi)有明顯的二聚體產(chǎn)生。將擴(kuò)增的目標(biāo)片段與T載體連接，測(cè)序結(jié)果得到序列大小為147 bp。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，溶解曲線、擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線依次見(jiàn)圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說(shuō)明反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有其他非靶標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生，引物特異性強(qiáng)，產(chǎn)物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準(zhǔn)確。

由圖5可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.216 66，說(shuō)明反應(yīng)的Ct值與質(zhì)粒濃度的拷貝數(shù)log值成反比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.980 82，說(shuō)明不同拷貝數(shù)與其對(duì)應(yīng)的Ct值具有很高的相關(guān)性，準(zhǔn)確性好，能用于后續(xù)進(jìn)一步的熒光定量分析。

2.4 內(nèi)生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，熒光擴(kuò)增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應(yīng)的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算芽胞桿菌DNA拷貝數(shù)的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數(shù)量。

2.5 檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，利用Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出的拷貝數(shù)范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經(jīng)芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數(shù)量均明顯大于空白處理。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了魔芋內(nèi)生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數(shù)據(jù)不能說(shuō)明該內(nèi)生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關(guān)系，因此，需要后面繼續(xù)進(jìn)行研究，檢測(cè)該內(nèi)生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關(guān)系。另外，該定量方法并不能說(shuō)明所檢測(cè)的內(nèi)生菌數(shù)量全部是芽孢桿菌BS-8，因?yàn)槟в笕~片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說(shuō)熒光定量PCR檢測(cè)的定殖芽孢桿菌含量并不準(zhǔn)確，因?yàn)闊晒舛縋CR并不能進(jìn)行物種分類(lèi)，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會(huì)被檢測(cè)到，單純的16S rRNA引物并不能用來(lái)對(duì)特異的某種微生物進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，尤其在比較復(fù)雜的微生物體中，如果要進(jìn)行更精確的分析，應(yīng)采用探針?lè)ㄟM(jìn)行研究。

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