低溫脅迫對油茶苗抗寒性的影響

文佳+張誠誠+曹志華+吳煒+胡娟娟+束慶龍

摘要：以大別山1號油茶（Camellia oleifera Abe1.）容器苗為試驗材料，研究在25、10、0和-10 ℃處理下，葉片丙二醛（MDA）含量、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性以及可溶性糖含量的變化。結(jié)果表明，隨著處理溫度的降低，油茶幼苗葉片MDA含量和POD、CAT活性以及可溶性糖含量變化幅度逐漸增大。25 ℃處理下，隨處理天數(shù)延長，油茶幼苗葉片MDA、可溶性糖含量及CAT、POD活性均無明顯變化；10 ℃和0 ℃處理4 d后，MDA和可溶性糖含量與25 ℃處理下相比分別增加了85.81%、180.43%和32%、92%，隨處理天數(shù)延長，CAT和POD活性呈下降趨勢，CAT活性分別降低了33%和40%，POD活性則分別降低14%和47%；-10 ℃處理下，隨處理天數(shù)延長，油茶幼苗葉片MDA含量急劇增加，增幅達319.47%，可溶性糖含量則先增加后停止增長，增幅為47%，而CAT和POD活性不斷下降，降幅分別為90%和71%。遭受10～0 ℃范圍內(nèi)的低溫脅迫處理，油茶幼苗尚能形成低溫適應機制，以抵御低溫對苗木帶來的傷害；而遭受-10 ℃及以下低溫處理時，油茶幼苗機體代謝機能則幾乎失去平衡。

關(guān)鍵詞：油茶（Camellia oleifera Abe1.）；低溫脅迫；丙二醛（MDA）；保護酶；可溶性糖

中圖分類號：S794.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0609-04

油茶（Camellia oleifera Abe1.）是世界四大木本油料樹種之一，也是中國特有的優(yōu)良食用油料樹種[1]。油茶適宜溫暖濕潤的氣候條件，要求年平均氣溫在14～22 ℃之間[2]，主要分布在中國南方17個省、市（自治區(qū)）[3]，其中安徽省大別山地區(qū)是油茶的重點產(chǎn)區(qū)之一， 也是油茶的邊緣產(chǎn)區(qū)[4]。油茶要求1月平均溫度不低于3 ℃，所以該地區(qū)油茶林冬季易遭受低溫凍害，輕則使其減產(chǎn)，重則致使整片油茶林死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失。目前對油茶抗寒性的研究主要集中在優(yōu)良抗性品種的選育和冬季有效的防寒措施等方面，對于油茶容器苗抗寒性生理的研究較少。

關(guān)于植物的抗寒性，自由基傷害學說[5]認為逆境脅迫會促進活性氧產(chǎn)生，活性氧過剩的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，損傷膜系統(tǒng)，作為膜脂過氧化產(chǎn)物，MDA含量的變化是質(zhì)膜損傷程度的重要標志之一[6]。有些酶如過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等可清除活性氧自由基， 從而防止自由基的毒害， 為此將它們稱為保護酶系統(tǒng)[7]。植物體內(nèi)可溶性糖的積累則與細胞的滲透壓有關(guān)，提高滲透濃度，降低水勢，增強保水力，通過調(diào)節(jié)滲透濃度來啟動脫落酸的形成，誘發(fā)蛋白質(zhì)的合成，增加抗寒性。因此植物體內(nèi)可溶性糖水平的提高對其抵抗低溫脅迫至關(guān)重要[8]。人們曾根據(jù)這一理論對低溫脅迫下的杉木[9]、紫花苜蓿[10]、水稻[11]、葡萄[12]等的抗寒機理進行了研究。為此，試驗對低溫脅迫下油茶幼苗葉片中MDA、保護酶及可溶性糖等指標進行了測定，以期為油茶苗圃管理和冬季抗寒實踐提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選取二年生的大別山1號油茶容器苗，將容器苗連容器袋移入高25 cm且底部有孔的塑料容器中，待幼苗適應20 d后，將幼苗分為4組，分別置于25、10、0和-10 ℃人工氣候箱內(nèi)進行處理。處理0、2、4 d時分別取第2～3片真葉測定幼苗各項生理參數(shù)，并將0 d處理組作為對照組。

1.2 方法

1）POD活性的測定。取2.0 g葉片（鮮葉，文中其他地方同），加入5.0 mL 62.5 mmol/L（pH 7.8）的磷酸緩沖液（內(nèi)含適量PVP）于冰浴上研磨，于4 ℃、15 000 g離心20 min，上清液為酶液，POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[13]。

2）CAT活性的測定。取0.3 g葉片，加入62.5 mmol/L的磷酸緩沖液30 mL研磨提取酶液，使用過氧化氫反應法測定CAT活性[14]。

3）MDA含量的測定。取0.5 g葉片，加入pH 7.5的50 mmol/L磷酸緩沖液10 mL，于冰浴中研磨提取，采用硫代巴比妥酸反應法測定MDA含量[15]。

4）可溶性糖含量的測定。按張志良[16]的方法測定可溶性糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用DPS 9.0軟件和Excel 2007進行分析。所列各值為參試油茶樣品在同一時間同一溫度處理下的平均值，取5株進行重復試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對大別山1號油茶幼苗葉片MDA含量的影響

圖1中25 ℃下的數(shù)據(jù)表明，未受低溫脅迫的油茶幼苗葉片MDA含量隨處理時間的延長無明顯變化。0、10與-10 ℃低溫處理下，MDA含量隨處理時間延長都呈上升趨勢。隨處理溫度的降低，相同處理時間下MDA含量升幅明顯增大，與對照相比，10 ℃處理4 d后MDA含量增加了85.81%，而0 ℃和-10 ℃處理4 d后MDA含量分別增加了180.43%和319.47%。

對不同溫度處理（對照除外）下植株MDA含量進行二因素試驗統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，不同溫度處理相同天數(shù)和同一溫度處理不同天數(shù)間植株MDA含量差異都顯著。

2.2 低溫脅迫對大別山1號油茶幼苗葉片保護酶活性的影響

2.2.1 POD活性的變化 從圖2可以看出，25 ℃處理組植株的POD活性隨處理時間的延長無明顯變化。其他3個溫度處理組，隨脅迫時間延長，植株P(guān)OD活性均下降。其中，10 ℃處理下，POD活性略有下降，處理4 d時降幅為14%。0 ℃處理2 d后植株P(guān)OD活性大幅下降，降幅為42%，處理4 d后POD活性又略降。-10 ℃處理下，POD活性在脅迫2、4 d時均大幅下降，4 d時POD活性較處理前下降了71%。3個不同低溫下處理4 d，-10 ℃處理組植株P(guān)OD活性降幅最大，0 ℃處理組次之，10 ℃處理組最小。

對低溫（對照除外）脅迫4 d后的油茶葉片POD活性進行二因素試驗統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，不同溫度處理相同天數(shù)和同一溫度處理不同天數(shù)間植株P(guān)OD活性差異都顯著。

2.2.2 CAT活性的變化 圖3表明，25 ℃處理組植株CAT活性隨處理時間延長變化微小。10、0和-10 ℃處理組中，隨脅迫時間延長，CAT活性都呈下降趨勢。其中，10 ℃和0 ℃處理2 d后，CAT活性降幅相對較大，分別為28%和35%，而4 d后降幅相對較小，均為8%。-10 ℃處理組的植株CAT活性在脅迫2 d后急劇下降，4 d后降至極低水平。同一處理時間下，處理溫度越低CAT活性降幅越大。除25 ℃處理組外，其余同一溫度不同處理天數(shù)間差異都達到顯著水平。

2.3 低溫脅迫對大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量的影響

通過圖4可知，25 ℃處理組葉片可溶性糖含量隨處理時間延長無明顯變化。10、0及-10 ℃低溫處理下，可溶性糖含量都隨處理時間延長而增加。10 ℃處理2 d后植株可溶性糖含量增加，增幅為30%，4 d后略有增加。而0 ℃處理下，可溶性糖含量2 d后僅略增加，4 d后大幅增長，增幅達68%。-10 ℃處理組2 d后可溶性糖含量開始上升，在同一時間該溫度處理組可溶性糖含量最高， 4 d時僅略有上升，且遠低于0 ℃處理組，但仍高于25 ℃和10 ℃處理組。

3 小結(jié)與討論

3.1 MDA含量與抗寒性的關(guān)系

在持續(xù)的低溫脅迫下，大別山1號油茶幼苗葉片中MDA含量增加。10、0 ℃處理2 d后MDA含量都急劇上升，說明油茶幼苗在突然遭到低溫襲擊的最初一段時間內(nèi)，機體本身的代謝功能特別是保護酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)突然失去平衡，導致活性氧的過量積累，膜脂過氧化作用加強。但隨后可能是體內(nèi)某些應激蛋白的調(diào)節(jié)作用[17]使保護酶的活性趨于穩(wěn)定，從而MDA含量也就不再大幅增加。此外，-10 ℃處理下MDA含量在4 d內(nèi)持續(xù)大幅增加，可能是由于過低的溫度致使機體的保護酶受到嚴重損害，活性急劇降低，活性氧清除能力亦大幅降低，導致膜脂過氧化作用不斷加強。

3.2 保護酶與抗寒性的關(guān)系

POD和CAT 在低溫脅迫中所起的作用已經(jīng)得到了許多證明[18-20]。CAT可分解H2O2，POD也可清除細胞內(nèi)有害自由基。3個低溫脅迫處理下，POD和CAT活性均呈下降趨勢，表明低溫對保護酶活性有抑制作用，且隨著溫度的降低，保護酶活性降幅增大。值得注意的是，10 ℃和0 ℃處理4 d后保護酶活性較2 d時僅稍有降低，說明大別山1號油茶幼苗在10 ℃和0 ℃處理下，保護酶活性開始略有降低，但隨后活性保持穩(wěn)定，而-10 ℃處理2 d和4 d后，保護酶活性持續(xù)降低，直至極低水平， -10 ℃低溫處理可能已使油茶機體保護酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)幾乎完全喪失平衡，無法再形成低溫適應機制。

3.3 可溶性糖含量與抗寒性的關(guān)系

隨著低溫脅迫時間的延長大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量上升，這與前人對酸棗的研究結(jié)果基本一致[21]。不同低溫處理下，大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量均增加，尤其是0 ℃處理下，可溶性糖含量增幅最大，說明0 ℃低溫脅迫可能最大程度地誘導了低溫適應機制的形成，導致機體增加可溶性糖濃度，提高自身抗寒性，而-10 ℃處理4 d后可溶性糖含量較2 d時基本不再增加，可能是由于突然的過低溫度處理導致機體代謝功能失衡，以致無法繼續(xù)生成大量可溶性糖。

綜上所述，活性氧代謝失調(diào)、膜脂過氧化是油茶幼苗受到低溫損傷的重要原因之一。10 ℃和0 ℃低溫處理下，油茶幼苗能夠形成低溫適應機制，表現(xiàn)出一定的抗寒性，當處理溫度低至-10 ℃，超出其抗寒性所能抵御的范圍時，則導致油茶幼苗機體代謝功能嚴重失衡，加劇膜脂過氧化程度，膜損傷嚴重。

參考文獻：

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[14] 李 霞，閻秀峰，于 濤.水分脅迫對黃檗幼苗保護酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].生態(tài)學報，2005，16（12）：2353-2356.

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[21] 徐 龍，唐 燕，王新建.不同酸棗實生苗抗寒性差異比較[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2012，41（10）：136-141.

對低溫（對照除外）脅迫4 d后的油茶葉片POD活性進行二因素試驗統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，不同溫度處理相同天數(shù)和同一溫度處理不同天數(shù)間植株P(guān)OD活性差異都顯著。

2.2.2 CAT活性的變化 圖3表明，25 ℃處理組植株CAT活性隨處理時間延長變化微小。10、0和-10 ℃處理組中，隨脅迫時間延長，CAT活性都呈下降趨勢。其中，10 ℃和0 ℃處理2 d后，CAT活性降幅相對較大，分別為28%和35%，而4 d后降幅相對較小，均為8%。-10 ℃處理組的植株CAT活性在脅迫2 d后急劇下降，4 d后降至極低水平。同一處理時間下，處理溫度越低CAT活性降幅越大。除25 ℃處理組外，其余同一溫度不同處理天數(shù)間差異都達到顯著水平。

2.3 低溫脅迫對大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量的影響

通過圖4可知，25 ℃處理組葉片可溶性糖含量隨處理時間延長無明顯變化。10、0及-10 ℃低溫處理下，可溶性糖含量都隨處理時間延長而增加。10 ℃處理2 d后植株可溶性糖含量增加，增幅為30%，4 d后略有增加。而0 ℃處理下，可溶性糖含量2 d后僅略增加，4 d后大幅增長，增幅達68%。-10 ℃處理組2 d后可溶性糖含量開始上升，在同一時間該溫度處理組可溶性糖含量最高， 4 d時僅略有上升，且遠低于0 ℃處理組，但仍高于25 ℃和10 ℃處理組。

3 小結(jié)與討論

3.1 MDA含量與抗寒性的關(guān)系

在持續(xù)的低溫脅迫下，大別山1號油茶幼苗葉片中MDA含量增加。10、0 ℃處理2 d后MDA含量都急劇上升，說明油茶幼苗在突然遭到低溫襲擊的最初一段時間內(nèi)，機體本身的代謝功能特別是保護酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)突然失去平衡，導致活性氧的過量積累，膜脂過氧化作用加強。但隨后可能是體內(nèi)某些應激蛋白的調(diào)節(jié)作用[17]使保護酶的活性趨于穩(wěn)定，從而MDA含量也就不再大幅增加。此外，-10 ℃處理下MDA含量在4 d內(nèi)持續(xù)大幅增加，可能是由于過低的溫度致使機體的保護酶受到嚴重損害，活性急劇降低，活性氧清除能力亦大幅降低，導致膜脂過氧化作用不斷加強。

3.2 保護酶與抗寒性的關(guān)系

POD和CAT 在低溫脅迫中所起的作用已經(jīng)得到了許多證明[18-20]。CAT可分解H2O2，POD也可清除細胞內(nèi)有害自由基。3個低溫脅迫處理下，POD和CAT活性均呈下降趨勢，表明低溫對保護酶活性有抑制作用，且隨著溫度的降低，保護酶活性降幅增大。值得注意的是，10 ℃和0 ℃處理4 d后保護酶活性較2 d時僅稍有降低，說明大別山1號油茶幼苗在10 ℃和0 ℃處理下，保護酶活性開始略有降低，但隨后活性保持穩(wěn)定，而-10 ℃處理2 d和4 d后，保護酶活性持續(xù)降低，直至極低水平， -10 ℃低溫處理可能已使油茶機體保護酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)幾乎完全喪失平衡，無法再形成低溫適應機制。

3.3 可溶性糖含量與抗寒性的關(guān)系

隨著低溫脅迫時間的延長大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量上升，這與前人對酸棗的研究結(jié)果基本一致[21]。不同低溫處理下，大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量均增加，尤其是0 ℃處理下，可溶性糖含量增幅最大，說明0 ℃低溫脅迫可能最大程度地誘導了低溫適應機制的形成，導致機體增加可溶性糖濃度，提高自身抗寒性，而-10 ℃處理4 d后可溶性糖含量較2 d時基本不再增加，可能是由于突然的過低溫度處理導致機體代謝功能失衡，以致無法繼續(xù)生成大量可溶性糖。

綜上所述，活性氧代謝失調(diào)、膜脂過氧化是油茶幼苗受到低溫損傷的重要原因之一。10 ℃和0 ℃低溫處理下，油茶幼苗能夠形成低溫適應機制，表現(xiàn)出一定的抗寒性，當處理溫度低至-10 ℃，超出其抗寒性所能抵御的范圍時，則導致油茶幼苗機體代謝功能嚴重失衡，加劇膜脂過氧化程度，膜損傷嚴重。

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[12] 王麗雪，李榮富，張福仁.葡萄枝條中蛋白質(zhì)、過氧化物酶活性變化與抗寒性的關(guān)系[J].內(nèi)蒙古農(nóng)牧學院學報，1996，17（1）：45-50.

[13] 李 霞，于 濤，閻秀峰. 光強對黃檗幼苗生長及抗氧化酶活性的影響[J].東北林業(yè)大學學報，2007，35（1）：25-30.

[14] 李 霞，閻秀峰，于 濤.水分脅迫對黃檗幼苗保護酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].生態(tài)學報，2005，16（12）：2353-2356.

[15] 鄒 琦.植物生理學實驗指導[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[16] 張志良.植物生理學實驗[M]. 北京：高等教育出版社，1990.

[17] LINDQUIST S， CRAIG E A. The heat shock proteins[J]. Annu Rev Genet，1988，22（1）：631-677.

[18] JOHN G S. Oxygen stress and superoxide dismutase[J]. Plant Physiol，1993，101（1）：7-12.

[19] BOWLER C， VAN MONTAGN C， INZE D. Superoxide dismutase and stress tolerance[J]. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol， 1992，43（1）：83-116.

[20] 王以柔，曾韶西，劉鴻先.冷鍛煉對水稻和黃瓜幼苗SOD、GR活性及GSH、AsA含量的影響[J]. 植物學報，1995，37（10）：776-780.

[21] 徐 龍，唐 燕，王新建.不同酸棗實生苗抗寒性差異比較[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2012，41（10）：136-141.

對低溫（對照除外）脅迫4 d后的油茶葉片POD活性進行二因素試驗統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，不同溫度處理相同天數(shù)和同一溫度處理不同天數(shù)間植株P(guān)OD活性差異都顯著。

2.2.2 CAT活性的變化 圖3表明，25 ℃處理組植株CAT活性隨處理時間延長變化微小。10、0和-10 ℃處理組中，隨脅迫時間延長，CAT活性都呈下降趨勢。其中，10 ℃和0 ℃處理2 d后，CAT活性降幅相對較大，分別為28%和35%，而4 d后降幅相對較小，均為8%。-10 ℃處理組的植株CAT活性在脅迫2 d后急劇下降，4 d后降至極低水平。同一處理時間下，處理溫度越低CAT活性降幅越大。除25 ℃處理組外，其余同一溫度不同處理天數(shù)間差異都達到顯著水平。

2.3 低溫脅迫對大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量的影響

通過圖4可知，25 ℃處理組葉片可溶性糖含量隨處理時間延長無明顯變化。10、0及-10 ℃低溫處理下，可溶性糖含量都隨處理時間延長而增加。10 ℃處理2 d后植株可溶性糖含量增加，增幅為30%，4 d后略有增加。而0 ℃處理下，可溶性糖含量2 d后僅略增加，4 d后大幅增長，增幅達68%。-10 ℃處理組2 d后可溶性糖含量開始上升，在同一時間該溫度處理組可溶性糖含量最高， 4 d時僅略有上升，且遠低于0 ℃處理組，但仍高于25 ℃和10 ℃處理組。

3 小結(jié)與討論

3.1 MDA含量與抗寒性的關(guān)系

在持續(xù)的低溫脅迫下，大別山1號油茶幼苗葉片中MDA含量增加。10、0 ℃處理2 d后MDA含量都急劇上升，說明油茶幼苗在突然遭到低溫襲擊的最初一段時間內(nèi)，機體本身的代謝功能特別是保護酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)突然失去平衡，導致活性氧的過量積累，膜脂過氧化作用加強。但隨后可能是體內(nèi)某些應激蛋白的調(diào)節(jié)作用[17]使保護酶的活性趨于穩(wěn)定，從而MDA含量也就不再大幅增加。此外，-10 ℃處理下MDA含量在4 d內(nèi)持續(xù)大幅增加，可能是由于過低的溫度致使機體的保護酶受到嚴重損害，活性急劇降低，活性氧清除能力亦大幅降低，導致膜脂過氧化作用不斷加強。

3.2 保護酶與抗寒性的關(guān)系

POD和CAT 在低溫脅迫中所起的作用已經(jīng)得到了許多證明[18-20]。CAT可分解H2O2，POD也可清除細胞內(nèi)有害自由基。3個低溫脅迫處理下，POD和CAT活性均呈下降趨勢，表明低溫對保護酶活性有抑制作用，且隨著溫度的降低，保護酶活性降幅增大。值得注意的是，10 ℃和0 ℃處理4 d后保護酶活性較2 d時僅稍有降低，說明大別山1號油茶幼苗在10 ℃和0 ℃處理下，保護酶活性開始略有降低，但隨后活性保持穩(wěn)定，而-10 ℃處理2 d和4 d后，保護酶活性持續(xù)降低，直至極低水平， -10 ℃低溫處理可能已使油茶機體保護酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)幾乎完全喪失平衡，無法再形成低溫適應機制。

3.3 可溶性糖含量與抗寒性的關(guān)系

隨著低溫脅迫時間的延長大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量上升，這與前人對酸棗的研究結(jié)果基本一致[21]。不同低溫處理下，大別山1號油茶幼苗葉片可溶性糖含量均增加，尤其是0 ℃處理下，可溶性糖含量增幅最大，說明0 ℃低溫脅迫可能最大程度地誘導了低溫適應機制的形成，導致機體增加可溶性糖濃度，提高自身抗寒性，而-10 ℃處理4 d后可溶性糖含量較2 d時基本不再增加，可能是由于突然的過低溫度處理導致機體代謝功能失衡，以致無法繼續(xù)生成大量可溶性糖。

綜上所述，活性氧代謝失調(diào)、膜脂過氧化是油茶幼苗受到低溫損傷的重要原因之一。10 ℃和0 ℃低溫處理下，油茶幼苗能夠形成低溫適應機制，表現(xiàn)出一定的抗寒性，當處理溫度低至-10 ℃，超出其抗寒性所能抵御的范圍時，則導致油茶幼苗機體代謝功能嚴重失衡，加劇膜脂過氧化程度，膜損傷嚴重。

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